紙層析分離中影響遷移率的因素有樣品物質結構、樣品分子極性、濾紙、層析溶劑、PH值、溫度、展開方式和樣品溶液中雜質等。
一、樣品物質結構和分子極性：
樣品物質結構和分子極性是影響遷移率的主要因素。
二、濾紙：
不同濾紙的厚薄和纖維松緊度各不相同，結合的水量不一樣。
濾紙上所含的雜質影響遷移率，必要時要進行預處理。
三、層析溶劑：
同一物質在不同的溶劑系統中進行層析分離時遷移率不同。溶劑系統中的試劑若純度不夠，需用離心機進行預處理。
四、PH值：
溶劑和樣品的PH值會影響物質的解離，從而影響物質的極性和溶解度，使遷移率改變。
溶劑的酸堿度增大，則流動相的含水量增大，使極性物質的遷移率增大。反之遷移率降低。
五、溫度：
溫度影響物質在兩相中的溶解度，即影響分配系數。溫度影響濾紙纖維的水合作用，即影響固定相的體積。在多元溶劑系統中，溫度顯著影響溶劑系統的含水量，即影響流動相的組分比例。所以溫度的改變使遷移率變化很大，紙層析分離必須在恒溫條件下進行。某些對溫度敏感的溶劑系統，最好不要配成飽和溶液。
六、展開方式：
同一物質在其它紙層析條件相同的情況下，不同的展開方式所得到的遷移率不同。
七、樣品溶液中雜質：
樣品溶液中雜質影響遷移率，必要時用離心機進行預處理。