納米孔測序重大升級，超高準確度，向臨床診斷邁進！

近年來，第三代基因測序技術發展迅速，在基因組學研究以及臨床疾病診斷領域備受青睞。該領域上游企業英國Oxford Nanopore Technologies（以下簡稱“ONT”）因其測序技術在樣本處理以及成本等方面占據較大優勢，而受到國內基因測序服務企業的鐘愛。相較于二代測序，三代測序技術擁有單分子無需擴增、長讀長等關鍵優勢，但其測序數據的準確性一直是相關應用的一大劣勢。為了克服這一劣勢，ONT納米孔測序技術不斷升級和改進。而就在上周，該公司發布了新型R10芯片，可以稱得上是一次重大的技術升級，極大程度上解決了三代測序數據準確性的問題。

圖1：新型R10芯片納米孔示意圖

　　據悉，新型R10芯片最大的更新是納米孔采用了雙讀取器（Reader）的設計。這使得R10芯片能夠對同一堿基進行兩次信號識別，測序準確度因此得到極大提升！相較于當前廣泛使用的R9.4.1版本芯片，R10芯片理論上對同一堿基的識別次數為R9.4.1芯片的2倍，因此可提供相當的讀長、產量及更準確的數據，且測序芯片的成本保持不變。

　　從R10芯片的內測結果來看，非常令人欣喜。在小型基因組樣本上，R10納米孔的共有序列準確度已達到Q50的水平——相當于每10萬個堿基中有1個錯誤，或99.999％的準確度。目前，該新型納米孔芯片已從內部測試使用過渡到早期試用階段，面向少數用戶進行開放測試。國內多家企業均已引入了該芯片系統。

　　那么，該系統在實際臨床應用中的表現如何？

　　今日，北京希望組生物科技有限公司（以下簡稱“希望組”）發布了基于Nanopore R10芯片系統對臨床上的一種罕見病，杜氏肌營養不良癥(Duchenne muscular dystrophy, 簡稱DMD)，陽性樣品的實地測試結果。接下來讓我們一睹為快。

圖2. 具有新型納米孔的R10芯片

　　據悉，希望組本次實驗中共測試了兩張R10芯片，分別檢測了1個人類DNA標準樣本，及2個加了barcode的DMD陽性參考品混合樣本。其中，兩個陽性參考品分別為1個點突變及1個缺失突變。測試采用完全相同的實驗方法對這兩個樣本的2.2 Mb DMD基因全長區域進行富集，然后分別上機測序。

　　為了充分測試R10對于準確度的提升，在本次評測過程中，希望組團隊采用了實時高準確度（High-Accuracy）模式進行測序。實時測序結果顯示，測序僅開始半小時后，單張芯片產出已達到230Mb，對于單個DNA標準樣本來說，相當于DMD基因全長100X的覆蓋深度，已經滿足后續分析的測序數據量。而當測序繼續運行至約16小時后，兩張芯片則分別產生3.3 Gb和3.9 Gb數據，遠遠超出單個樣本所需數據量，這就為后續臨床樣本的檢測提供了更多策略上的可能性。

　　R10實測下機數據展示

　　通過對測序數據的初步質控，R10芯片在read質量方面的表現令人驚艷不已：pass reads提供了平均超過20的質量值（Qscore），而mapping后的reads準確度更是多數分布在95%以上！

圖3. R10實測數據Pass read質量分布圖

　　利用高質量R10數據檢測DMD突變

　　杜氏肌營養不良（Duchenne Muscular Dystrophy，DMD）是一種常見的遺傳性神經肌肉疾病，具有X連鎖的隱性遺傳模式。DMD基因全長2.2Mb位于X染色體上，是人類基因組中最大的基因之一，具有79個外顯子，其突變類型主要包括：大片段的缺失或重復、微小突變（包括堿基的置換、重復、缺失或插入）和剪切區突變。由于DMD基因中有超過60%的突變均為大片段SV，為三代長讀長測序的天然優勢“戰場”，那么接下來就一起來看看高質量R10數據在檢測DMD變異方面的能力吧！

　　希望組團隊對pass reads數據進行拆分，采用clairvoyante軟件默認參數，在其中一個DMD陽性參考品中，成功檢出一個C>T單堿基突變位點，排除掉少量由于拆分錯誤導致的reads錯誤比對，突變頻率接近100%（圖4）。

圖4. 檢測到的SNV示意圖

　　而對另外一個DMD陽性參考品采用sniffles軟件默認參數進行比對時發現，在X染色體p21.1區段可以成功檢測到一個26Kb的大片段deletion（圖5）突變頻率也接近100%，與參考基因組比對后可以清晰地看到reads的兩個斷點區域（圖6）。

　　以上這兩個結果都與預期相符。

圖5 . 大片段deletion示意圖

圖6. 與參考基因組比對read斷點示意圖

　　從實測數據來看，Nanopore R10芯片不僅保持了ONT在大片段SV上的檢測優勢，同時在單堿基致病變異檢測方面也展現出強大的潛力，在read準確度方面表現搶眼，一改之前大家對于三代測序單堿基質量差的印象，使得ONT在向臨床診斷方向的應用又邁進了一大步。

　　基于Nanopore R10芯片最新實測數據，希望組CEO汪德鵬表示：“三代測序在解決單堿基準確度問題方面一直是個難點。希望組一直致力于突破技術的極限，從本次實測數據來看，高質量R10數據在檢測DMD陽性樣本SNP和SV方面實現了革命性的突破，極大地提高了單堿基準確度。我們現在只是初步的測試，后續還會繼續加大樣本量，持續不斷地在推動三代測序精準診斷領域不斷努力！”

　　相信，隨著更多企業實測數據的發布，未來三代測序必將帶來更多亮眼的表現。我們也共同期待三代測序技術未來在遺傳病、腫瘤、輔助生殖、病原微生物檢測等疾病領域的取得更多的突破性進展。