凝乳酶的凝乳作用分為兩個步驟：第一步是酶專一性的水解乳中κ-酪蛋白多肽鏈的Phe105-Met106之間的肽鍵，形成穩定副κ-酪蛋白及親水性糖巨肽；第二步是當總的κ-酪蛋白被水解掉約80%時，在鈣離子存在下通過在酪蛋白膠粒間形成的化學鍵形成凝塊或凝固的乳。這是由于κ-酪蛋白分子位于酪蛋白膠束表面，亞基之間以疏水鍵和膠體磷酸鈣相互作用的方式連接在一起。
