Mullis博士在發明PCR技術后曾這樣描述：“用一個單分子DNA，PCR能在一個下午內產生100百萬個相似的分子。反應很容易進行，只需要一個管子、一些簡單的試劑和一個用來加熱的設備”（Beginning with a single molecule of the genetic material DNA, the PCR can generate 100 billion similar molecules in an afternoon. The reaction is easy to execute. It requires no more than a test tube, a few simple reagents, and a source of heat）
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30年來，PCR技術就如同阿基米德拿來撬動地球的杠桿一樣撬動了生命科學研究的每一個領域。30年，PCR技術剛好發展到了第三代：
第一代PCR就是常見的定性PCR技術，它采用普通PCR儀來對靶基因進行擴增，采用瓊脂糖凝膠電泳來對產物進行分析。定性PCR有幾個缺點：1)采用毒性較大的核酸染料，會對實驗人員和環境造成傷害，2)容易發生污染而造成假陽性結果，3)檢測耗時長，操作繁瑣，4)只能定性檢測產物的有無，而不能對起始模板量進行定量。
第二代PCR就是熒光定量PCR技術（Real-Time PCR，qPCR），熒光定量PCR誕生于1992年，它通過在反應體系中加入能指示反應進程的熒光試劑來實時監測擴增產物的積累，借助熒光曲線的Cq值來定量起始靶基因的濃度。熒光定量PCR需要借助校準物制備的標準曲線來定量，因此實際上是一種相對定量方法。而且不同廠家生成的儀器確定Cq值的方法不同，甚至同一個廠家還有多種確定Cq值的方法，實驗者也可以根據自己的經驗隨意調節Cq值，這就直接造成了人與人之間、儀器與儀器間、實驗室與實驗室間的定量結果可比性差；熒光定量PCR也存在多個問題，如校準品和樣品間背景不同而引入偏差、難以檢測低拷貝數的靶DNA、樣品與校準物的擴增效率不同、DNA提取中引人的雜質或DNA降解影響PCR的動態擴增等。
第三代PCR技術--數字PCR（Digital PCR，dPCR，Dig-PCR），是一種全新的對核酸進行檢測和定量的方法。它采用直接計數目標分子而不再依賴任何校準物或外標，即可確定低至單拷貝的待檢靶分子的絕對數目。
Vogelstein和Kinzler第一次描述了數字PCR的概念，用于在大量正常細胞群中檢測少數含突變的細胞（如結腸直腸癌的致癌基因）。通過稀釋樣品DNA到每兩個檢測孔中才有一個分子，經PCR擴增后，向每個孔中加入特異性結合突變型的熒光探針和既能與突變型結合也能與野生型結合的熒光探針與產物雜交，然后直接計數樣本中突變型和野生型等位子的數量。數字PCR要通過使用統計分析（如貝葉斯估計）來評估等位基因分布同正常值不同的可能性強度，因此將傳統PCR的指數的模擬信號轉換成線性的數字信號。
數字PCR的靈敏度取決于分析中采用的檢測孔的數目和聚合酶的固有突變率。在聚合酶的保真性難以提高很大的情況下，增加分析孔的數量可有效提高檢測的靈敏度。現代數字PCR的發展趨勢是采用微滴式方法替代傳統的稀釋方法，通過對樣品進行微滴化處理，將含有核酸分子的反應體系分散成千上萬個納升級的微滴，其中每個微滴或不含待檢核酸靶分子，或者含有一個至數個待檢核酸靶分子。經PCR擴增后，逐個對每個微滴進行檢測，有熒光信號的微滴判讀為1，沒有熒光信號的微滴判讀為0，根據泊松分布原理即可得出樣品中靶分子的起始拷貝數。
數字PCR技術主要應用在以下幾個方面：突變分析、評估組織內的等位基因失衡、體液DNA的癌癥檢測、混雜DNA的癌癥檢測、定量特異等位基因的基因表達等。
游引物F1和下游引物R1擴增的區域包含待檢的突變位點。使用過量的引物R1，經不對稱PCR擴增，產生可以同分子信標互補的單鏈DNA。綠色探針位于突變位點之外，因此既可以同野生型等位基因結合，也可同突變型等位基因結合。而紅色探針只能識別和結合野生型等位基因。因此存在野生型DNA的孔能檢測到紅色熒光和綠色熒光兩種熒光，而存在突變型DNA的孔檢測到綠色熒光則相比紅色熒光大大過量。
一對分子信標引物設計用來擴增一段約100bp的PCR產物，這段產物的中部包含一個單核苷酸多態性（SNP）位點。兩個分子信標除了同SNP位點互補的堿基和標記的熒光分子外，完全相同。綠色和紅色分別代表熒光素和hex標記。游離狀態的分子信標的信號被3'-dabcyl基團猝滅而不發出熒光。當同互補序列雜交時，分子信標發出熒光。樣品DNA被分配到384孔PCR板中，經PCR反應后，向每個孔中加入分子信標以確定等位基因狀態。數字PCR和基于分子信標的等位基因鑒別也可整合到一步反應進行。
參考文獻：
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Vogelstein B, Kinzler K W. (1999) Digital PCR. Proc Natl Acad Sci USA 96:9236-9241
李亮, 隋志偉, 王晶, 臧超, 余笑波 (2012) 基于數字PCR的單分子DNA定量技術研究進展. 生物化學與生物物理進展 39(10):1017-1023