神經元的電生理檢測

實驗概要

本部分將以大鼠腦片的神經元為例，描述神經元的電生理檢測過程。本檢測是利用玻璃微電極檢測電流的方法，來測定單個神經元的電生理反應。

主要試劑

電極液

主要設備

玻璃微電極、顯微鏡、視頻攝像系統、顯微操作儀、膜片鉗、電極holder。

實驗材料

大鼠腦片的神經元

實驗步驟

（1）將玻璃微電極固定在電動操作臂上。注意，充滿液體后，玻璃電極中不能有氣泡。液體的量以剛好浸沒氯化銀線的尖端為宜。擰緊操作臂的蓋子，緩慢推動推電極，以避免電極尖端進入液面時挑起下面的灰塵。電極要位于視野中間，液面之上（低倍放大，如×5），然后慢調焦距，同時將電極緩緩浸入液體，直到尖端清晰為止。
（2）對空電極施加一個測試脈沖（如，5mV/10ms），用歐姆定律計算電極的電阻（適合的電阻值為3-5歐姆；大多數膜片鉗配備的軟件能自動計算該值）。將鏡頭移到待測物（此處是大鼠腦片），浸沒鏡頭，并將其聚焦于電極尖端。依次放低待測物和電極，直到尖端剛好位于待測物的表面。
（3）轉到熒光鏡下，將感興趣的細胞位于視野中間，在DIC模式下確認細胞。關閉熒光通路的shutter，用電極逐漸緩慢接近細胞，并持續施加正壓力，直到細胞上出現一個小凹點。在示波器或電腦屏幕上觀察測試脈沖下的反應，并改變正壓，直至產生輕微的吸力。此時的反應應該保持不變，除了有輕微的峰值，出現在測試電壓的起始和終止時。
（4）將電流歸零，電壓設為-80mV。這樣能避免大量鈣離子在穿破細胞的同時流入，致使細胞過去極化而死亡。逐漸增加吸力，同時在示波器或顯示器上觀察細胞反應，直至電流出現。該電流的出現源于給細胞本身，cell capacitance（Cm），需要用歸零補償。現在Cm，Rm和series resistance（Rs）的值都已被確定。
（5）穩定而持續的電流剛剛出現（＜100pA），開始記錄。決定電流的因素，除了穩定與細胞緊密契合的電極之外，電極液的組成也極大的影響到電流的值。因此，要等待神經細胞中的細胞液和電極中的液體交換完成。根據不同的擴散速率，交換可能在幾十至數百米內完成，等待數分鐘是合適的。這個等待的時間間隙還能保證，讓組織中泄漏的電極液完成擴散，避免如K離子等，對周圍的神經元產生影響。交換完成的電極液使電極能夠記錄負的膜電位和發放模式，而這類模式是神經細胞成熟程度的重要標志。記錄膜電位的記錄方式能記錄的是全細胞的電流，通過這種方式可以間接了解電壓門控的Na離子和K離子電流。另外，用這種方式保持膜電壓在-60至-80mV數分鐘，可以記錄突觸自發產生的膜電流。由于電極液中有大量的Cl離子，在該電壓下，谷氨酸能GABA將觸發突觸后膜的負電位（EGlu約為0mV，ECl約為-38mV）。根據要記錄的電流種類的不同，也應采用不同的電極液的組分。比如，以Cl離子為主要的陰離子的溶液，能夠很好的記錄GABAa受體導致的突觸后電流，而對微弱的興奮性突觸后電流（EPSCs）的記錄中，常常用到含有葡糖酸鹽和甲基磺酸鹽的溶液。
（6）在記錄的最后階段，轉換到熒光鏡下，觀察并記錄熒光的“回流”現象。轉換的過程必須輕柔，避免碰斷電極。