由于糖解作用的最后步驟是個難逆反應，因此在糖質新生的過程中，需要一個替代途徑，才能將丙酮酸還原成磷酸烯醇丙酮酸。首先丙酮酸必需要先在丙酮酸羧化酶（Pyruvate carboxylase）的催化之下，消耗ATP分子并轉變成草酰乙酸（Oxaloacetate）。
之后草酰乙酸又會經由磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶（Phosphoenolpyruvate carboxykinase）的催化，生成磷酸烯醇丙酮酸，在這個反應中，會消耗掉GTP，并生成GDP與二氧化碳。
與前后反應不同的是，以上的兩個反應是在線粒體中進行。而且除了直接轉變之外，草醋酸還可以利用另一個需要更多步驟的途徑，來生成磷酸烯醇丙酮酸。此外，從磷酸烯醇丙酮酸的生成直到果糖-1,6-雙磷酸產生為止，中間的糖質新生過程皆是糖解作用的逆反應。