直接分辨單個氨基酸分子小小納米孔破解蛋白質測序難題

蛋白質是生命活動的主要承擔者。測量組成蛋白質的氨基酸的排列順序被稱為蛋白質測序。由于缺乏普適、高效的測序技術，人類對蛋白質的了解還極其有限，生命世界的諸多奧秘仍待破解。

近日，浙江大學化學系馮建東團隊提出了基于固體納米孔的氨基酸識別方法。他們構建了直徑為1納米左右的人工納米孔，可進行單個氨基酸分子的精準識別，分辨率達到0.94道爾頓。這顯示出人工納米孔應用于單分子蛋白質測序的可能性。相關研究論文發表于《自然·通訊》。

一項持續了60多年的挑戰

1951年，英國科學家弗雷德里克·桑格完成了對胰島素的測序工作，并因此獲得諾貝爾化學獎。這是人類第一次測定蛋白質的氨基酸組成，從此人們認識到蛋白質具有特定的氨基酸序列。

但此后，桑格在蛋白質測序方面陷入了持續10年的瓶頸期。他轉而嘗試進行DNA測序和RNA測序，發明了后來被稱為“桑格測序法”的雙脫氧測序法。該方法被廣泛應用于測定基因和基因組序列，這項發明改寫了整個生命科學的研究進程和途徑，引領了人類三大科學計劃之一的基因組計劃和基因測序領域的飛速發展。

基因測序方法發展迅猛，而與之相較，蛋白質測序發展無疑是滯后的。“蛋白質測序‘起跑’比基因測序早，但沒有像基因測序技術那樣被廣泛應用。”浙江大學生命科學研究院研究員蔣超說，比起基因，人們對蛋白質的了解要少得多。基于此，一種普適高效的蛋白質測序手段的誕生有著重大意義。

相比于基因測序，蛋白質測序遇到的主要困境在于其結構復雜且構成的單元氨基酸具有更強的異質性，這意味著蛋白質測序手段所需的檢測靈敏度要高得多。蛋白質也沒有類似核酸擴增的技術，導致目前人們難以分析低豐度蛋白質，因此在單分子層面上對蛋白質進行測序的需求日益迫切。

蔣超介紹，目前測量蛋白質的氨基酸序列的主流方法是利用質譜儀，但此方法在檢測速度、讀取長度和靈敏度方面還存在很多不足之處，其效力遠不及基因組學和轉錄組學。

“納米孔主要可分為兩大類，一類是生物納米孔，一類是固體納米孔，目前應用較多的生物納米孔本身由肽鏈折疊而成，所以其靈敏度受限于納米孔本身的尺寸。”馮建東認為，要解決蛋白質測序的研究需求，必須從根本上突破傳統納米孔靈敏區域的長度限制。

納米孔“盲盒”挑戰測量極限

想搞懂納米孔測序，不妨將其理解為一個拆盲盒的過程。假設盲盒里有一條項鏈，玩家僅知道這條項鏈由幾顆珠子構成，不同顏色珠子的排列方式要靠猜測。

馮建東說，盲盒里如果是某個基因“項鏈”，對應基因有4種不同的堿基，猜的就是4種顏色珠子的排列順序。而對于蛋白質“項鏈”來說，組成蛋白質的有20種天然氨基酸，其排列組合數量就將飆升到天文數字。

“結構決定分辨能力。如果我們把單個的孔做到足夠小，只容許孔內有一個氨基酸分子，那么它的信息就有可能被精確識別。”馮建東介紹，團隊嘗試人工創造一個具有單個氨基酸敏感性區域、幾乎是目前世界上最小的人工納米孔，這樣納米孔測量的“盲盒”內就可以僅存1個氨基酸。

“類似于不同體型的人過一扇窄門，有的人可以順利通過，有的人則會被擋在門外。”馮建東說，科研人員通過電壓在一張三層原子厚度的二硫化鉬上“戳”出一個洞，其實是讓它丟掉一些原子，開出一扇僅容許一個氨基酸通過的“門”。這扇“門”的直徑在亞納米到1.6納米之間。

“不同氨基酸的體積不同，且表面帶一定的電荷，當它們通過納米孔時，通過納米孔的離子電流會受到微小的擾動。當不同的氨基酸經過這扇‘門’時，受到的擾動程度就會不一樣。”團隊成員、浙江大學化學系博士生王馥實介紹，研究人員通過區分擾動程度來識別不同的氨基酸。

蛋白質單分子測序再進一步

研究人員通過對納米孔的極限結構的設計，將當前納米孔測量分辨率推進到0.94道爾頓，實現了直接分辨單個氨基酸分子的目標，并且可在同一納米孔內區分16種不同類型的天然氨基酸，解決了納米孔蛋白測序空間分辨率的核心難題。

馮建東認為，使用納米孔高精度識別單個氨基酸的策略，為納米孔單分子蛋白質測序提供了物理解析的可行性基礎。

自然界的蛋白質分子有著難以想象的復雜性，除了序列，不同的化學修飾的變化也會產生豐富的“變異”，而這些“變異”與人類疾病息息相關。比如，蛋白質的異常糖基化修飾會導致多種重大疾病，如白血病、阿爾茨海默病等。

蛋白質的磷酸化修飾在細胞周期、生長、凋亡和信號轉導等過程中起著重要的調控作用。在這項工作中，研究人員實現了用納米孔來識別氨基酸的磷酸化。這一結果表明納米孔未來有望應用于醫學檢測，助力疾病診斷和預防。

“目前，我們的方法可以用于分辨不同的單個氨基酸分子；將來，希望能夠一次性識別更復雜組合的多肽鏈，以及復雜的化學修飾。”馮建東表示，蛋白質測序是目前納米孔領域最受關注的應用之一，單個氨基酸分子的識別是一個好的開端，后續如何完成對從氨基酸到肽鏈，再到復雜折疊的蛋白質的識別仍是更大的挑戰和機遇。