甲基化特異性PCR確定DNA甲基化的模式

樣本 DNA

NaOH對苯二酚重亞硫酸鈉礦物油DNA Wizard cleanup kit (Promega) 或等同物異丙醇糖苷配糖基乙酸胺乙醇10 X PCR 擴增緩沖液4dNTP 混合物Taq DNA 聚合酶

水浴設備Vacuum manifold帶控制管溫度顯示和適合管的熱循環儀

1.把樣品 DNA(達 1ug) 稀釋到 1.5 ml 微離心管中的 50ul 水中。如果使用的 DNA 更少（包括從石蠟包被的樣品提取的 DAN)，預期的產量少（如很微弱的條帶）或者增加循環次數提高產量。準備好陽性和陰性對照 DNA 的稀釋液和樣品平行進行以下步驟。

2.加入 5.5ul 2mol/L NaOH。37°C，孵育 lOmin。加入 3u1 新鮮配置的 l0mmol/L 對苯二酚和 520ul 新鮮配置的 3mol/L 重亞硫酸鈉。混勻并加入足量的礦物油（約 50ul) 用以覆蓋水相。50°C 孵育 16 h。

3.除去油。加入 1ml DNA Wizard 試劑，把混合物加到試劑盒帶有的 niiniprep 柱。真空處理。用 2ml 80% 異丙醇洗。把柱子置于一個干凈的 1.5 ml 管，加入 50ul 60~70°C 的水。離心管子和柱子 1min。每管加入 55ul 3mol/L NaoH，室溫孵育 5 min。

4.加入 1ul 10mg/ml 糖苷配糖基，然后加入 17ul 10mol/L 乙酸胺和 3 體積 100% 的冰凍乙醇。-20°C，沉淀 DNA 幾小時或過夜，離心 20 mm，去上清，用冰凍的 70% 的乙醇清洗，加入 20~30 ul 水溶解。處理單鏈 DNA 要像處理 RNA—樣（冷凍，盡量減小反復凍融，可能的話保存在-70℃。

5.進行甲基化和非甲基化反映所要分析的樣品的數目，包括陽性和非 DNA 對照。準備好甲基化和非甲基化 PCR 反應（50ul) 的主要反應混合物，包括：

5ul 10XPCR 擴增緩沖液；

2.5ul 25 mmol/L 4dNTP 混合物；

1ul 300ng/ul 的有義引物；

1ul 300ng/ul 的反義引物；

28.5ul 水。

混勻。

6.取 3.8ul 主要反應混合物到標記的 PCR 管。每管加人 2ul 重亞硫酸鈉修改的 DNA 模板（第 4 步）。如果需要，每管加入 25~50ul 的礦物油，放入熱循環儀。PCR 從 95°C 變性 5 min 開始。

7.對每個樣品，取 1.25U Taq DNA 聚合酶稀釋到 10ul 無菌蒸餾水中。通過油層加入到 40ul 混合物中，并輕輕地吹打。也可以選擇用其他形式熱啟動 PCR。按如下所示繼續 PCR 擴增。

35 個循環：

30s 95℃ (變性)

30s 不同的引物溫度不一樣 (退火)

30s 72℃ (延伸)

最終步驟：
4min 72℃ (延伸)

4°C 保存反應產物直至分析。

8.準備 6%~8%(m/V) 非變性聚丙烯酰胺膠，用 1 X TBE 緩沖液作溶劑（單元 7.2)。10V/cm 跑垂直膠 1?2 h，每個樣品的反應產物在相鄰的泳道，這樣可以對甲基化和非甲基化位點之間進行直接的比較。包括陽性和陰性對照。

9.用溴化乙鍵染膠，在 UVtransilluminator 觀察并對膠進行拍照（附錄 3G)。一般情況下，產物的范圍是 80~200bp。

一般情況下，產物的范圍是 80~200bp。

來源于精編人類遺傳學實驗指南，第十章