| 實驗方法原理 | 藻酸鹽微珠培養基于在軟骨細胞藻酸鹽懸液中氯化鈣的膠凝作用。 |
|---|---|
| 試劑、試劑盒 | 軟骨切除培養液 生長培養液 分離軟骨細胞的酶液 胰蛋白酶和EDTA混合液 藻酸鈉溶液 膠凝液 溶解液 |
| 儀器、耗材 | 無菌磁鐵 |
| 實驗步驟 | 切除軟骨 1. 自膝關節、肩關節和髖關節取軟骨。由于胚胎或幼年供體的軟骨比成年供體獲得較多細胞，較長時間后才衰老，故胚胎或幼年供體的軟骨優于成年供體。生后一個月的 Fauve de Bourgogne 兔或新西蘭兔較理想。然而，成年人手術切除的髖關節也是軟骨細胞的合適來源。 2. 切除軟骨之前，用 CDM （軟骨切除培養液（cartilage dissection medium，CDM）：Ham’s F12 培養液（In-vitrogen），添加 20 μg/ml 蔡替米星（Sigma）、10 μg/ml 萬古霉素（Sigma）和30 μg/ml 頭孢他啶（Sigma）。CDM 用于切開關節和切取軟骨，也用于酶消化）徹底清洗關節組織。切除軟骨越早越好。除去關節處的皮膚、肌和肌腱。仔細切下軟骨，不要帶上結締組織。 分離細胞 為了預防軟骨變干，在盛有 CDM 的 100 mm 培養皿（未用 TC 處理）內操作。 下列操作程序中使用的酶液量適用于取自一只兔的膝關節和肩關節的軟骨，但必須根據切除軟骨的多少確定酶液量。 分離軟骨細胞的酶液： (a)0.05%豬胰蛋白酶（Sigma），用 Ham’s F12 配制； (b)0.3% Ⅰ型膠原蛋白酶（Worthington，CLSI），用 Ham F12 配制； (c)0.06% 膠原蛋白酶，用 Ham F12配制，加入 10 % FCS。 將 3 種酶液用 0. 22 μm 濾器過濾除菌。 3. 用十字刀片將軟骨片切成 1 mm3 小塊。 4. 將軟骨塊移入 30 ml 平底小瓶。 5. 加入 10 ml 0.05% 胰蛋白酶，將小瓶封起來，在室溫條件下用適度磁力攪拌消化 25 min 。 6. 組織塊沉下后，除去胰蛋白酶液。 7. 加入 10 ml 0.3 % 膠原蛋白酶，將小瓶封起來，在室溫條件下用適度磁力攪拌消化 30 min 。 8. 組織塊沉下后，除去膠原蛋白酶液。 9. 加入 10 ml 0.06 % 膠原蛋白酶。 10. 將組織塊懸液移入 100 mm 細菌培養級培養皿。用 10 ml 0.06 % 膠原蛋白酶浸洗小瓶后，將浸洗液移入培養皿。然后，放入培養箱，在 37°C 和 5 % CO2 的條件下孵育過夜。 11. 將細胞懸液移入 50 ml 離心管，然后用旋渦混合器混合片刻。 12. 用孔徑為 70 μm 尼龍濾器（BD Biosciences）濾去消化后殘留的組織。 13. 將過濾液離心（400 g，10 min）。 14. 用 20 ml CDM 混懸細胞，然后用血細胞計數板計數。 15. 離心（400 g，10 min）。 包埋細胞 16. 用 1 ml 藻酸鈉溶液混懸細胞，然后逐漸用藻酸鈉溶液稀釋細胞懸液，直至細胞密度為 2×106 個/ml。逐漸稀釋對于獲得均一的藻酸鹽細胞懸液是有必要的。 藻酸鈉溶液：1.25% （W / V）藻酸鈉（Fluka），用 20 mmol/L HEPES 和 0.15 mol/L 氯化鈉配制 配制方法： (a)使用加熱的攪拌器，將 HEPES 溶入 0.15 mol/L 氯化鈉，然后加熱至約 60°C； (b)加入藻酸鈉，繼續攪拌，直至完全溶解。溶解時間需 2 h 以上； (c)由于加入酸（鹽酸或硫酸）導致不可逆轉的沉淀，用 1 mol/L NaOH 仔細調整 pH 至 7.4，但不要超過 7.4。分裝溶液后，在121 °C 條件下高壓滅菌 10 min。 另一種配制方法：在微波爐內，藻酸鈉很快溶入 HEPES 和氯化鈉混合液，時間約10 min 。但是，須注意避免烤焦。 17. 通過 21G 針頭將細胞懸液滴加入適度磁力攪拌著的膠凝液（102 mmol/L 氯化鈣，5 mmol/L HEPES，pH 7.4）中，使藻酸鹽聚集 10 min，形成微珠。 18. 用 5 倍容量的 0.15 mol/L 氯化鈉將微珠洗 3 次。 19. 將 5 ml 微珠（1×107 個細胞）放入含有 20 ml 生長培養液（DMEM （含 1 μg/L 葡萄糖）和 Ham F12 混合液（1 : 1，V / V )，添加 4 μg/ml 慶大霉素和 10% FCS）的 75 cm2 培養瓶。 20. 在 37°C 以及濕潤的 5 % CO2 和 95 % 空氣的條件下培養。 使細胞恢復 21. 吸出培養液。 22. 將兩倍容量的溶解液（50 mmol/L EDTA，10 mmol/L HEPES，pH 7.4）加在微珠上。 23. 在 37°C 條件下孵育 15 min。 24. 離心（400 g，10 min）。 25. 用含有 0.06% 膠原蛋白酶的生長培養液混懸細胞。 26. 在 37°C 以及濕潤的 5 % CO2 和 95 % 空氣的條件下，培養 30 min。 27. 離心（400 g，10 min）。 28. 用無血清 DMEM 和 Ham F12 混合培養液混懸細胞，然后用血細胞計數板計數。 29. 離心（400 g，10 min）。 30. 重復操作步驟 28、29，但不計數細胞。 |
| 注意事項 | 1. 須比較各批血清對于軟骨細胞生長和分化細胞表型的作用，如通過免疫標記 Ⅱ 型膠原蛋白評價血清的作用。選用一批血清時，應購買幾個月的用量，避免經常換用血清。 2. 應將新用的膠原蛋白酶與以前使用的比較，試驗分離軟骨細胞的有效性。 |
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