實驗方法原理 T4 噬菌體多核苷酸激酶催化的交換反應（Van de Sande et al. 1973; Berkner and Folk 1977) 是一個標記 5' 端 DNA 的快速方法。與正向反應不同的是，它無需 DNA 去磷酸化。正向反應在略偏酸性（pH 6.4）的咪唑緩沖液中進行，以刺激酶促去磷酸化 (Berkner and Folk 1977)。交換反應的最佳 Km 值（ADP 為 300 μmol/L，ATP 為 10 μmol/L），均比在試驗管中容易達到的值高，因此標記效率很少超過 30%。然而，交換反應效率通過在反應混合物中加入亞精胺和聚乙二醇大為改善（Lillehauget al. 1976; Harrison and Zimmol/Lmerman 1986a)。
實驗材料 T4 噬菌體多核苷酸激酶DNA
試劑、試劑盒 ADP乙酸銨ATPEDTA乙醇咪唑緩沖液聚乙二醇
儀器、耗材 液體閃爍計數儀Sephadex G-50 離心柱Sephadex G-50 柱
實驗步驟
一、材料
1. 緩沖液和溶液
ADP (1 mmol/L)
乙酸銨（10 mol/L）
ATP (10 mmol/L)
EDTA ( 0.5 mol/L，pH 8.0)
乙醇
10X 咪唑緩沖液（500 mmol/L 咪唑鹽酸（pH 6.4），180 mmol/L MgCl2，50 mmol/L DTT，1 mmol/L 亞精胺鹽酸，1 mmol/L EDTA (pH 8.0)）
聚乙二醇（24% m/V PEG 8000，水配制）
2. 酶和緩沖液
T4 噬菌體多核苷酸激酶
3. 核酸和寡核苷酸
DNA (10~50 pmol m 5'-磷酸化的末端）
4. 放射性化合物
[γ-32P] ATP ( 10 mCi/ml，比活性為 3000~7000 Ci/mmol）
5. 專用設備
液體閃爍計數儀，能通過切侖科夫輻射定量 32P
Sephadex G-50 離心柱，用 TE（pH 7.6) 平衡
或
Sephadex G-50 柱（1 ml)，用 TE ( pH 7.6) 平衡
二、方法
1. 在一個微量離心管中按下列順序混合：
含 5' 末端磷酸的 DNA 10~50 pmol
10X 咪唑緩沖液 5 μl
1 mmol/L ADP 5 μl
50 nmol/L ATP 1 μl
10 mCi/ml [γ-32P] ATP
（比活性為 3000~7000 Ci/mmol) 20~100 pmol
水 加至 40 μl
24% (m/V) PEG 10 μl
T4 噬菌體多核苷酸激酶（20 單位） 1 μl
輕彈管外壁以混合各成分，37℃ 溫育反應 30 min。
2. 加入 2 μl 0.5 mol/L EDTA ( pH 8.0) 以終止反應。用液體閃爍計數儀的切侖科夫計數檢測反應混合物中的總放射性活度。
3. 通過下列任一方法分離放射性標記探針與未摻入dNTP：
用 Sephadex G-50 離心柱層析
或
用 1 ml Sephadex G-50 柱（用 TE 平衡）常規尺寸排阻層析
或
進行兩輪乙酸銨和乙醇選擇性沉淀放射性標記的 DNA
4. 通過契侖科夫計數測定探針制品中的放射性量，用探針中放射性含量除以反應混合物中的放射性總量來計算放射性標記物轉移到 5' 端的效率。