生物工程方法阻斷部分基因功能對抗艱難梭菌感染

艱難梭菌感染是一個全球性的公共健康問題，它已于2013年被美國疾病與預防控制中心列入最高緊急威脅級別的耐藥菌首位。

“我們的研究主要有兩個創新點，一是從尋找艱難梭菌感染的宿主因子出發，二是使用自創的高效、經濟的RNAi基因篩查方法。”

艱難梭菌（Clostridium difficile）是一種抗生素耐藥菌，在使用抗生素，尤其是過量使用抗生素時，很容易出現艱難梭菌感染（CDI）。通常，艱難梭菌通過口腔進入人體內并保持休眠狀態，直到在大腸中感染并釋放毒素，破壞組織。這些毒素會殺死細胞，從而導致腹瀉、腹痛、發燒，在極端情況下會致命。

近日，美國微生物學會期刊《mBio》發布昆山杜克大學（Duke Kunshan University）全球健康研究中心、新彤生物化學實驗室黃林峰副教授等人的研究成果。該研究揭示了艱難梭菌感染造成的組織損傷的關鍵基因片段，阻斷特定的基因功能，有可能用于治療艱難梭菌的感染。

據“昆山杜克全球健康”公眾號報道，論文的主持者黃林峰表示，艱難梭菌感染是一個全球性的公共健康問題，它已于2013年被美國疾病與預防控制中心列入最高緊急威脅級別的耐藥菌首位。在中國，艱難梭菌感染的影響也非常廣泛，但是對它的研究還不充分。

該項研究的成員之一、昆山杜克大學自然與應用科學部生物實驗室講師李迎雪博士對實驗過程進行介紹：“我們開創了一種新型基因篩查法，利用細菌細胞制造了數千個精確基因靶向的RNA分子，即小干擾RNA(siRNA)。然后我們使用高通量方法去測試這些siRNA，并使用生化檢測和顯微鏡觀察的方式，去了解在艱難梭菌毒素誘導下siRNA在細胞死亡中所發揮的作用。最后，我們初步篩選出最有可能的候選基因，再通過各種實驗室技術驗證它們是否在艱難梭菌毒素誘導的細胞損傷中產生了效果。”

研究發現，在艱難梭菌導致的細胞凋亡中，有幾個新的基因發揮了重要作用。主持這項研究的黃林峰解釋：“通過阻斷這部分的基因功能可減輕艱難梭菌毒素所造成的細胞死亡，而這個方法可以用于感染后的相關治療。中藥化合物甘草甜素（Glycyrrhizin）能夠阻斷其中一個候選基因HMGB1的功能。在我們培養的細胞和動物模型中進行了測試，結果表明，其對艱難梭菌毒素引起的細胞和組織損傷具有強大的保護作用。”

11月8日，澎湃科技連線黃林峰，解讀該項成果。

抗生素治療“兩難”

黃林峰表示，艱難梭菌感染很難治。一般感染艱難梭菌的人都是需要使用抗生素的患者，或是住院很久的老年人，他們體質本就虛弱，感染艱難梭菌后會對腸道造成非常大的損傷，嚴重的情況需要手術干預。

由于艱難梭菌的抗生素耐藥性，在人體內幾乎所有的正常細菌都被抗生素殺死后，艱難梭菌會留下來，大量繁殖，產生大量毒素。傳統治療艱難梭菌感染的方法是使用更強的抗生素，包括萬古霉素（vancomycin）、非達霉素（fidaxomicin）和甲硝唑（metronidazole），但是治療后常有復發。

據黃林峰介紹，在艱難梭菌感染療法的研究上，近期主要有兩個新進展。一是針對艱難梭菌毒素的抗體，目前美國默沙東的抗體藥Zinplava（bezlotoxumab）已經被用于艱難梭菌的治療，但是抗體藥物價格昂貴，而且必須和抗生素聯用。

另一種方法是腸道菌群移植，即把非常健康的人糞便中的菌群提取富集，通過食道或灌腸的方法移植到患者體內，讓患者有機會借此重建自己身體的正常菌群，和艱難梭菌抗爭。但是找到真正健康無害的菌群并不容易，需要篩選供體，重建菌群的過程也很復雜，且移植后并非每一個人都能受益。

黃林峰向澎湃科技表示，“我們的研究主要有兩個創新點，一是從尋找艱難梭菌感染的宿主因子出發，二是使用自創的高效、經濟的RNAi基因篩查方法。”

艱難梭菌主要通過毒素A、毒素B和二元毒素（binary toxin）三個毒素來產生作用，其中導致細胞損傷的主要毒素是毒素B。因此，他們希望在細胞模型上找到毒素B導致細胞死亡的關鍵基因，進而尋找針對性的治療方法。

首創高效、經濟的生物工程RNA生產方法

在實驗中，黃林峰團隊使用一種自創的新型基因篩選方法，即用生物工程的方法來生產siRNA（小干擾RNA）分子。該方法的好處在于可以降低成本，簡單、便宜地生產高效的小干擾RNA。

黃林峰介紹，小干擾RNA可以通過RNAi通路精準地調控靶基因的表達，從而有效抑制導致疾病的關鍵基因。

“一般做RNAi基因篩查會使用化學合成的小干擾RNA，需要向公司購買化學合成的產品。如果要買幾萬個不同基因序列的小干擾RNA做高通量的篩查，價格非常昂貴，一般只有大型醫藥企業和高級的研究機構才有能力去做。我們創造的生物工程方法能讓細菌自己合成小干擾RNA分子，因此可以做到以低廉的成本來生產小干擾RNA分子庫。”黃林峰說。他還表示，他們的小干擾RNA分子庫可以針對特定細胞和研究體系進行個性化的生產，因此更加精準和高效。