生化實驗講義(理論部分)——層析技術（六）

5. 洗脫速度

洗脫速度也會影響凝膠層析的分離效果，一般洗脫速度要恒定而且合適。保持洗脫速度恒定通常有兩種方法，一種是使用恒流泵，另一種是恒壓重力洗脫。洗脫速度取決于很多因素，包括柱長、凝膠種類、顆粒大小等，一般來講，洗脫速度慢一些樣品可以與凝膠基質充分平衡，分離效果好。但洗脫速度過慢會造成樣品擴散加劇、區帶變寬，反而會降低分辨率，而且實驗時間會大大延長；所以實驗中應根據實際情況來選擇合適的洗脫速度，可以通過進行預備實驗來選擇洗脫速度。一般凝膠的流速是2－10 cm / hr，市售的凝膠一般會提供一個建議流速，可供參考。

總之，凝膠層析的各種條件，包括凝膠類型、層析柱大小、洗脫液、上樣量、洗脫速度等等，都要根據具體的實驗要求來選擇。例如樣品中各個組分差異較小，則實驗要求凝膠層析要有較高的分辨率，提高分辨率的選擇應主要包括：選擇包括各個待分離組分但分離范圍盡量小一些的凝膠，選擇顆粒小的凝膠，選擇分辨率高的凝膠類型，選擇較長、直徑較大的層析柱、減少加樣量、降低洗脫速度等等。但正如前面講過的，各種選擇都有一個限度的問題，超過這個限度可能會產生相反的效果。另外需要提的一點是，實驗時應盡可能的參考相關實驗和文獻以及進行預實驗，以選擇最合適的實驗條件。

3.2.7 凝膠層析的應用

前面介紹了凝膠層析的基本理論以及基本實驗操作，下面簡單介紹一下凝膠層析在生物學方面的應用。

1. 生物大分子的純化

凝膠層析是依據分子量的不同來進行分離的，由于它的這一分離特性，以及它具有簡單、方便、不改變樣品生物學活性等優點，使得凝膠層析成為分離純化生物大分子的一種重要手段，尤其是對于一些大小不同，但理化性質相似的分子，用其它方法較難分開，而凝膠層析無疑是一種合適的方法。例如對于不同聚合程度的多聚體的分離等。

2. 分子量測定

前面已經介紹了，在一定的范圍內，各個組分的Kav以及Ve與其分子量的對數成線性關系。

      Kav＝－b lg MW＋c

      Ve＝－b’ lg MW＋c’

由此通過對已知分子量的標準物質進行洗脫，作出Ve或Kav對分子量對數的標準曲線，然后在相同的條件下測定未知物的Ve或Kav，通過標準曲線即可求出其分子量。凝膠層析測定分子量操作比較簡單，所需樣品量也較少，是一種初步測定蛋白分子量的有效方法。這種方法的缺點是測量結果的準確性受很多因素影響。由于這種方法假定標準物和樣品與凝膠都沒有吸附作用，所以如果標準物或樣品與凝膠有一定的吸附作用，那么測量的誤差就會比較大；上面公式成立的條件是蛋白基本是球形的，對于一些纖維蛋白等細長的形狀的蛋白不成立，所以凝膠層析不能用于測定這類分子的分子量；另外由于糖的水合作用較強，所以用凝膠層析測定糖蛋白時，測定的分子量偏大，而測定鐵蛋白時則發現測定值偏小；還要注意的是標準蛋白和所測定的蛋白都要在凝膠層析的線性范圍之內。

3. 脫鹽及去除小分子雜質

利用凝膠層析進行脫鹽及去除小分子雜質是一種簡便、有效、快速的方法，它比一般用透析的方法脫鹽要快得多，而且一般不會造成樣品較大的稀釋，生物分子不易變性。一般常用的是Sephadex G-25，另外還有Bio-Gel P-6 DG或Ultragel AcA 202等排阻極限較小的凝膠類型。目前已有多種脫鹽柱成品出售，使用方便，但價格較貴。

4. 去熱源物質

熱源物質是指微生物產生的某些多糖蛋白復合物等使人體發熱的物質。它們是一類分子量很大的物質，所以可以利用凝膠層析的排阻效應將這些大分子熱源物質與其它相對分子量較小的物質分開。例如對于去除水、氨基酸、一些注射液中的熱源物質，凝膠層析是一種簡單而有效的方法。

5. 溶液的濃縮

利用凝膠顆粒的吸水性可以對大分子樣品溶液進行濃縮。例如將干燥的Sephadex（粗顆粒）加入溶液中，Sephadex可以吸收大量的水，溶液中的小分子物質也會滲透進入凝膠孔穴內部，而大分子物質則被排阻在外。通過離心或過濾去除凝膠顆粒，即可得到濃縮的樣品溶液。這種濃縮方法基本不改變溶液的離子強度和pH值。