理化檢測法：理化檢測法是通過抗生素分子的特殊反應或性質，如高效液相色譜法，測定其堿性基含量的方法，氣相色譜法、比色法、熒光分光光度法等，最常用的是高效液相色譜及其組合技術。
這些方法不僅可以用于定性分析，而且可以用于定量檢測，檢測速度快，靈敏度、特異性和分辨率都很高，重復性好，應用廣泛。但其檢測要求高，需要昂貴的檢測設備，檢測程序復雜，檢測成本高，且普遍用于科研，難以推廣到基層應用。
1、高效液相色譜法：高效液相色譜（HPLC）是近年來發展最快的一種快速分離分析技術。介紹了氣相色譜原理，采用高壓泵、高效固定相、高靈敏度檢測器等技術，實現了分離速度快、效果好、操作自動化，幾乎所有待測化合物包括高極性／離子型化合物和大分子物質都能用高效液相色譜法測定。
2、色譜－質譜法：GC－MS是分離、定量和定性（分子結構信息）相結合的產物，特別適用于驗證性分析。可用于色譜條件、程序的控制和數據的處理。具有良好的特異性、敏感性和重復性。可同時完成同一樣品中多種藥物及其代謝產物的檢測。
3、微生物生長抑制法：其測定原理是根據抗生素對微生物生理功能和代謝的抑制作用，對樣品中的抗生素殘留進行定性或定量測定。它的大多數工作菌株是敏感菌株，如枯草芽孢桿菌、嗜熱芽孢桿菌、岡比亞肉瘤。
4、紙面法：PD法（紙片法），當樣品中含有抗菌物質時，在紙片周圍形成一個清晰的抗菌圈。在檢測過程中，在培養基中加入溴甲酚紫指示劑。當樣品含有抑菌物質時，紙張周圍有一個清晰的淡藍色抑菌圈。
5、酶比色法：酶比色法來源于penzyme法，是一種快速檢測牛奶中β－內酰胺類抗生素的定量酶比色法。其原理是測定β－內酰胺類抗生素對DD羧肽酶的滅活程度。