6. 轉基因的生化分析
( 1 ) 對轉基因和非轉基因植株的整株或不同的器官進行轉基因的生化分析，如 GUS 分析（圖 10.2 (e )~（h ) ; [ 48 ] ) 。
( 2 ) 為去除葉綠素，將綠色組織先在 70% 乙醇中浸泡 2 h，然后在 100% 乙醇中過夜處理（此步驟應在在 37℃ 孵育后進行）。
( 3 ) 抽真空以去除組織中的氣體。
( 4 ) 將樣品浸入 GUS 底物中 [ 10 mmol/L EDTA (pH 7.0 ) 、0.1 mol/L NaPO4 (pH 7.0)、1~5 mmol/L X-Gluc；X-Gluc 可溶解在二甲基亞砜中；Sigma] , 抽真空后立即在 37°C 孵育（57 ) 。
( 5 ) 為了觀察 GUS 表達部位，制作徒手橫切片，然后在 Zeiss SV8 體視鏡或 Zeiss Axioskop 常規顯微鏡下觀察。
7. hva1 轉基因植株在脅迫條件下的評價
(1) 離體培養條件下的鹽脅迫
① 取轉基因和非轉基因每個株系 50 或 60 粒種子的種子；見注 12) 進行表面消毒。每皿 MS7 培養基（25 ml/皿）上播 10~12 粒種子，于 25°C 暗培養萌發 4 天（見注 13)。非轉基因的種子用不加草胺膦或雙丙胺膦的 MS7 培養基。
② 將萌發種子分為兩組，一組不加鹽脅迫而另一組生長在鹽脅迫條件下。
③ 從每一獨立的轉基因和非轉基因株系中移出 4~5 棵正在生長的苗到加有 NaCl 或沒有 NaCl 的 MS8 培養基上（50~70 ml/Magenta) ，在 25°C 和 60 μmol/( m2·s ) 的光照條件下生長。最少 4 個重復。
④ 6 天后，觀察轉基因和非轉基因植株在加鹽和不加鹽條件下的生長狀況 [ 圖 10.2 ⑴ ] 。
⑤ 進行了測定，如植株鮮重（見注 14 )、株局、根長、干 重（見注 15；表 10. 3) 。
⑥ 對數據進行方差分析 [58]。
⑦ Tukey's 差距檢測法在 95% 置信度水平上比較均值。
⑧ 將植株移栽至泥炭：珍珠巖（1 : 1，V/V ) 混合的混合土中，并在溫室中進一步生長。
(2) 溫室（盆播）條件下的鹽脅迫
① 依照 3.7.1 節中的方法在 MS7 培養基上萌發種子。
② 將 1 周大小經過篩選的轉基因苗和非轉基因對照苗移到小盆（8 cmx 4 cmx 6 cm) 中的混合土中，該混合土中泥炭：珍珠巖為 1 : 1 (每盆一株苗）。
③ 將這些盆放在加水的平底盤中，并在溫室中生長 1 周。
④ 將生長中的苗分成 5 組，每組中轉基因和非轉基因株系分別取 8~10 棵苗。在鹽脅迫處理前測定每一株的株高和葉數。
⑤ 用不同濃度的鹽溶液 （0 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L、150 mmol/L 和 200 mmol/L NaCl) 澆灌植物，每天一次持續 14 天（見注 16)。
⑥ 隨后用水澆灌 1 周讓植株恢復。
⑦ 之后，重新不間斷進行 5 周鹽脅迫處理。
⑧ 實驗至少進行 4~5 次重復。
⑨ 測定單株株高、根長、分蘗數、單株結實率。比較轉基因和非轉基因植株在脅迫和非脅迫條件下的生長差異 [見注 1 7 ; 圖 10. 2( j ) 和圖 10. 2 ( k ) ] 。
⑩ 對數據進行方差分析統計 [58]。
⑾ Tukey's 差距檢測法在 95% 置信度水平上比較均值（表 10.4 ) 。
(3) 離體培養條件下缺水或滲透脅迫
① 參照 3. 7 .1 節的方法，在 MS7 培養基上萌發種子（R。、R1 、R2) (見注 18)。
② 將萌發的種子分成兩組：一組生長在不缺水或沒有滲透脅迫的條件下，另一組生長在缺水或有滲透脅迫的條件下（見注 19)。
③ 將每一獨立的轉基因和非轉基因株系的 4~5 株苗移到 Magenta 盒中加有甘露醇或沒有甘露醇的 MS9 培養基上（50~70 ml/Magenta) ，在 25℃ 光照條件下生長。最少 4~5 個重復。
④ 6 天后，分析轉基因和非轉基因植株在滲透脅迫和非滲透脅迫條件下的生長狀況。
⑤ 和鹽脅迫條件下一樣對植株的生長狀況進行測定。比較轉基因和非轉基因植株在脅迫和非脅迫條件下的生長差異（表 10. 3) 。
⑥ 將植株移栽到混合土中，其中泥炭與珍珠巖按 1 : 1 ( V /V ) 混合，使其在溫室中進一步生長。
(4) 溫室（盆播）條件下缺水脅迫實驗
① 參照 3. 7 .1 節的方法，在 MS7 培養基上萌發 30~40 粒種子(見注 20)。
② 將 1 周大小的、經過篩選的轉基因苗與未經篩選的非轉基因苗作對照，移到裝有混合土的小盆中（8 cmx4 cmx6 cm) ，該混合土為泥炭與珍珠巖 1 : 1 混合，每盆栽一株苗。
③ 將盆放置于加水的平底盤中，缺水處理前讓植株在溫室中生長 2 周。
④ 將植株分成加水（a 組）和缺水（b 組） 兩組，每一組中轉基因和非轉基因株系各用 8~10 棵苗。在脅迫處理前測定每一株的株高和葉片數。
⑤ 在 a 組植株的平底盤中加水，持續 1 周。
⑥ 在 b 組植株的平底盤中只加水 2 天。
⑦ 加水 2 天后，完全去除 b 組平底盤中的水，以后的 1 周內處于缺水環境。
⑧ 重復這一過程 5 周。
⑨ 結束后，測定每一株的株高分蘗數。比較轉基因和非轉基因植株在脅迫和非脅迫條件下的生長差異。
⑩ 用方差分析進行數據統計 [58]。
⑾ Tukey's 差距檢測法在 95% 置信度水平上比較均值。