液質聯用技術中基質效應的評價方法

　　 在人體生物等效性或臨床藥代動力學試驗中，液質聯用技術被廣泛用于生物樣品中藥物及其代謝物濃度的檢測。液質聯用技術具有高靈敏度和高特異性的顯著特點，研究者往往會認為采用該技術可以簡化或者省去樣品的前處理和色譜分離步驟。但由于質譜檢測是基于化合物離子化并通過特定的核質比來檢測和定量，因此任何干擾待測物離子化的物質都可能影響檢測方法的靈敏度和選擇性，即引入了基質效應的概念。基質效應是指在樣品測試過程中，由待測物以外的其他物質的存在，直接或間接影響待測物響應的現象。由于質譜檢測的高選擇性，基質效應的影響在色譜圖上往往觀察不到，即空白基質色譜圖表現為一條直線，但這些共流出組分會改變待測物的離子化效率，引起對待測物檢測信號的抑制或提高。這些基質成分包含了生物樣品中的內源性成分和樣品前處理過程中引入的外源性成分。內源性組分包括無機鹽或者膽汁中的有機鹽、各種有機化合物（糖類、胺類、尿素、類脂類、肽類）和分析目標物的同類物及其代謝物。外源性組分盡管在生物樣品中不存在，但同樣會產生基質效應，包括處理樣品的塑料管中殘留的聚合物、離子對試劑、有機酸、緩沖液、SPE柱材料、抗凝管中的抗凝劑如EDTA或肝素鋰等。FDA在生物分析方法建立的指導原則中明確提出對于基于LC/MSn的方法，在整個分析過程中需通過適當的方法減少基質效應的影響，從而保證方法的靈敏度和選擇性；EMEA在《生物分析方法的驗證指導原則（草案）》中更加細化了基質效應的評判標準。

　　2. 評價方法

　　 目前評價基質效應的方法主要有兩種：（1）柱后灌注法（Post-column infusion method）和（2）提取后加入法（Post-extraction spiking method）。其中柱后灌注法能直觀的顯示基質效應對被測物色譜保留時間的影響范圍和影響程度，適合在色譜方法篩選過程中評估基質效應的影響情況，為色譜條件的優化提供信息。而提取后加入法不僅能量化絕對基質效應的程度，也能提供相對基質效應的數據，因此廣泛運用于方法學驗證過程。

　　2.1 柱后灌注法

　　 柱后灌注法屬于動態分析基質效應的方法，將針泵及液相色譜系統通過T型進樣閥與質譜儀相連。將空白樣品按待測樣品的處理方法提取后，利用待測樣品的洗脫條件通過HPLC進行色譜洗脫，同時用針泵將特定濃度的被測物以恒定速度注入，兩種溶液一并通過T型進樣閥進入質譜儀，進行待測物離子信號強度檢測。被測物信號響應的變化將直接反應生物基質對于被測物的影響，同時信號強度隨時間的變化關系也有助于色譜條件的優化。

　　2.2 提取后加入法

　　 提取后加入法在評定LC-MSn基質效應中使用的最多，而且，此法還可用于評價絕對基質效應（absolute ME，基質效應影響分析的程度）和相對基質效應（relative ME，樣品間基質效應大小的差異）。

　　2.2.1 絕對基質效應的評價

　　 利用下述方法制備兩組待測樣品。

　　 Set 1：將被測物溶于非生物基質的空白溶液，如：配制成甲醇、乙腈等標準溶液。

　　 Set 2：提取空白生物基質，濃縮復溶形成溶液，將被測物加入此溶液中。

　　 將上述Set1和Set2樣品引入LC/MSn系統進行分析，獲得待測物和內標的信號強度，其中待測物或內標在Set2和Set1中信號強度的比值 (Set2/Set1)為絕對基質效應，可以用基質效應因子(matrix factor，MF)來表示，待測物與內標MF的比值稱為內標歸一化基質效應因子(IS-normalized MF)[3]。絕對基質效應結果主要影響分析方法的準確度。

　　2.2.2 相對基質效應的評價

　　 相對基質效應大小可以用IS-normalized MF的變異系數(CV)來判斷。具體步驟如下：選擇至少六個不同來源的生物基質，利用2.2.1方法測定上述生物基質中待測物和內標的MF（待測物濃度通常選擇一個低濃度即可，其濃度應在3×LLOQ以內），并計算內標歸一化基質效應因子，利用獲得的6個內標歸一化基質效應因子計算變異系數，其值應小于 15%。

　　 如果由于某些特殊情況比如全自動在線樣品處理、收集和測定過程，無法中斷程序按照上述流程制備得到set1和set2，則需要考察待測物和內標在不同生物樣品（至少6個不同個體的來源）中響應強度的差異，以此來證明基質效應對于未知生物樣本的測定結果影響可以忽略。具體步驟如下：

　　(1)利用至少6個不同來源的生物樣品制備一定濃度（3×LLOQ以內）的待測標準品（每個生物樣品同時至少制備3份）；

　　(2)按正常樣品測試方法測定這些待測標準品的濃度；

　　(3)計算精密度（CV表示）和準確度，其中CV應小于15%；而準確度平均值的偏差應在15%以內，對任何樣品，如果其準確度偏差超過20%則需要額外考察并判斷原因。

　　 對于方法驗證而言，相對基質效應的結果直接影響方法的準確度和精密度，較絕對基質效應更為重要，因此EMEA在《生物分析方法的驗證指導原則（草案）》中并沒有就絕對基質效應作出限制標準，而是要求6份內標歸一化基質效應因子的CV<15%。不過需要注意的是如果絕對基質效應影響過大，通常會表示基質對于方法的影響很大，往往導致精密度的實驗結果不符合要求，因此在方法建立之初，如果條件允許，應盡可能降低絕對基質效應。

　　3. 克服基質效應的方法

　　克服基質效應的方法包括下面幾種：

　　(1) 選擇合適的樣品預處理方法：常用的樣品的處理方法包括蛋白沉淀，液液萃取（LLE）和固相萃取（SPE）。通常 利用LLE或 SPE制備的樣品內源性雜質較少，有助于降低絕對基質效應。但樣品前處理過程的復雜會降低分析檢測的效率，增加污染的風險，并可能帶來待測組分的損失，也直接影響待測組分的提取回收率。因此在樣品制備方法的選擇中要兼顧基質效應和提取回收率兩方面的因素，選擇合適的樣品制備方法。

　　(2)改變被測物的色譜分離條件：即通過優化色譜分離條件使得內源性雜質與待測物分離。采用反相色譜法分離時，最初流出的主要是基質中的極性成分，而這些極性成分往往是引起基質效應的主要原因。當待測組分的色譜保留時間較短時（<3min），其受基質效應影響較大。因此，改善色譜分析條件，適當地延長待測組分的保留時間（但要兼顧樣品運行時間延長帶來的峰展寬、靈敏度下降的問題），有利于減少基質對測定的影響。

　　(3)采用性質相近或穩定同位素內標：如果絕對基質效應影響較大，但內標和被測物的絕對基質效應接近，仍可認為方法可行。但需注意的是，如果絕對基質效應太大，通常會造成方法的變異很大。而且當多個分析物同時檢測時，由于存在極性差異，即使是同類物的同位素內標也很難抵消基質效應，從而造成定量結果偏差。因此在方法建立的初期，仍建議采取可行的方法降低絕對基質效應。

　　(4)采用小進樣量。在保證靈敏度的情況下，采用小進樣體積，可以適當降低基質效應。由于自動進樣器的廣泛應用，目前即使很小的進樣體積也能實現良好的進樣精密度。

　　(5)利用液相色譜電解質效應（LC-electrolyte effects）：利用在流動相中添加極少量不同的有機酸/堿促進待測物離子化，從而減少基質效應的影響。

　　(6)使用較低的流速：在LC/MS中，尤其是使用ESI離子源時，較低的流速可以使同時離子化的化合物減少，降低了待測成分與基質成分在電離過程中的競爭，從而減弱基質效應。

　　(7) 改用不同的離子源：目前用于定量的離子源主要是電噴霧離子源（ESI）和大氣壓化學離子源（APCI），通常ESI對于基質效應的敏感程度要高于 APCI。對于特定的化合物，特別是對于蛋白質沉淀法處理的樣品，若采用ESI有明顯的基質效應，更換成APCI源或大氣壓光離子源（APPI）可能是一種簡單易行的方法。

　　4. 結論

　　 液質聯用技術對生物樣品分析造成的影響是個復雜的問題，受到化合物本身、生物基質、樣品前處理過程、色譜條件和不同離子化模式等因素的影響，對于它的控制標準目前除EMEA的《生物分析方法的驗證指導原則（草案）》較明確外，FDA、SFDA還沒有明確一致的指導意見，然而在臨床試驗中對生物樣品進行絕對基質效應和相對基質效應的考察將會是一個趨勢。

　　 本文僅就基質效應評價的方法及如何消除或減小基質效應進行了簡單的討論，希望引起國內臨床研究單位加強對生物樣品分析過程中基質效應問題的重視，有意識的在研究中積累實驗數據，從而進一步提高分析檢測結果的準確度和精密度。