流式細胞術的樣品制備（七種樣品的制備方法）（二）

四、外周血單個核細胞的制備

1．取外周血2ml，肝素抗凝，用生理鹽水將血稀釋成4ml，混勻；

2．將稀釋后的血液沿試管壁徐徐加入4ml淋巴細胞分離液ficoll到液面之上，勿用力過大，以免造成血液與分離液混合，保持清晰地分層狀態；

3．離心2000r/min，30min，室溫18~20℃，離心后可見試管內的血液清楚地分為4層，上層為血漿層，中層為分離液層（單個核細胞處于血漿層和分離液層中間），底層為紅細胞層，紅細胞層上為粒細胞層；

4．用吸管將上層與中層之間的單個核細胞層吸出收集到另1試管中，用生理鹽水洗2遍，每次均以1500r/min，離心10min，棄上清后即得到高純度的單個核細胞懸液；

5．用適當的固定液固定或置低溫冰箱保存待用。

五、骨髓細胞單細胞懸液的制備

1．無菌抽取骨髓液0.5ml;

2．將骨髓標本滴入含1000U/ml肝素抗凝劑的1ml PBS液中；

3．再加入PBS液稀釋至10ml；

4．用吸管吸取5ml稀釋骨髓液徐徐加入盛有4ml的人類淋巴細胞分離液液面之上；

5．以上條件下，骨髓有核細胞分層在PBS-人類淋巴細胞分離液之間形成的界面上；

6．取有核細胞層，加入到10ml PBS液中，混勻；

7．以1000r/min離心5min，棄上清，收集骨髓細胞，加固定液或置低溫冰箱備用。

六、單層培養細胞單細胞懸液的制備

1．棄去培養細胞(對數生長期)中的舊培養液，加入1～2ml 0．25％胰蛋白酶，倒置顯微鏡下觀察，見細胞稍變圓時，停止胰蛋白酶作用。也可直接觀察培養瓶，靜置消化2～3分鐘，待細胞逐漸變白，有脫落趨勢時，立即豎立培養瓶，停止胰蛋白酶作用，棄去胰蛋白酶；

2．加入3～4ml無鈣離子和鎂離子的PBS液，用吸管反復吹打，使其分散為單個細胞懸液，移人離心管中；

3．短時低速離心，即800~1000r/min，離心5min；

4．去掉上清液，加入5~8ml PBS液，低速短時離心，800~1000r/min，離心3~5min；重復2~3次，以去除細胞懸液中的細胞碎片。

5．加少許PBS液，將沉淀細胞輕輕吹打均勻。加固定液或低溫保存待用。

七、脫落細胞單細胞懸液的制備

在臨床工作中，可以收集到大量自然脫落細胞，這些細胞標本經過簡單處理，便可成為較好的單細胞懸液供流式細胞術分析。主要包括脫落細胞、胸腹水細胞、尿液、內鏡刷檢細胞等。

（一）食管拉網細胞的單細胞懸液的制備

1．將食管拉網器上的細胞洗脫到20ml PBS液中，以1500r/min離心后，再用PBS液洗2次，離心500~800r/min，1~2min，棄上清；

2．再加入PBS液5ml，以300目尼龍濾網過濾，離心沉淀去上清；

3．加少許PBS液混勻沉淀細胞，加固定液或低溫保存，備用。

（二）尿液脫落細胞的單細胞懸液的制備

1．用以清潔器皿收集24h尿液，置4℃冰箱中自然沉淀2h，輕輕倒去上清液，留下少許帶細胞的沉淀物，用吸管移至10~20ml離心管中；

2．500r/min離心10min，去上清；

3．加PBS液8~10ml，以1000r/min離心10min，去上清，重復再洗1次；

4．再加5ml PBS液混勻，用300目尼龍濾網過濾，離心沉淀去上清；

5．再加少許PBS液，混勻。加固定液或低溫保存，備用。

（三）胸、腹水脫落細胞的制備

1．抽取胸、腹水50~100ml，加入1000U/ml肝素液1ml，放鹽水瓶中置于4℃冰箱中靜置6~12h，棄去上清；

2．將底部10~20ml用長吸管移入試管中，用PBS液洗3次，以1500r/min離心沉淀5min；

3．再加5ml PBS液混勻，用300目尼龍濾網過濾，離心沉淀去上清；

4．加少許PBS液，混勻；加固定液或低溫保存，備用。

（四）沖洗液細胞樣品的制備

1．用300~500ml生理鹽水沖洗膀胱，沖洗一定時間后，吸出沖洗液放入容器中于冰箱內置6~12h；

2．取沉淀液20~40ml，離心沉淀并以生理鹽水洗2次，吸上清；

3．加10ml PBS液，混勻，以300目尼龍濾網過濾，離心沉淀去上清；

4．過濾后1000r/min，10min，離心沉淀，去上清；加固定液或低溫保存備用。