慢病毒也被廣泛地應用于表達RNAi的研究中。由于有些類型細胞脂質體轉染效果差，轉移到細胞內的siRNA半衰期短，體外合成siRNA對基因表達的抑制作用通常是短暫的，因而使其應用受到較大的限制。采用事先在體外構建能夠表達siRNA的載體，然后轉移到細胞內轉錄siRNA的策略，不但使脂質體有效轉染的細胞種類增加，而且對基因表達抑制效果也不遜色于體外合成siRNA，在長期穩定表達載體的細胞中，甚至可以發揮長期阻斷基因表達的作用。在所構建的siRNA中，是由RNA聚合酶Ⅲ啟動子來指導RNA合成的，這是因為RNA聚合酶Ⅲ有明確的起始和終止序列，而且合成的RNA不會帶poly A尾。當RNA聚合酶Ⅲ遇到連續4個或5個T時，它指導的轉錄就會停止，在轉錄產物3’端形成1~4個U。U6和H1 RNA啟動子是兩種RNA聚合酶Ⅲ依賴的啟動子，其特點是啟動子自身元素均位于轉錄區的上游，適合于表達～21ntRNA和～50ntRNA莖環結構（stem loop）。在siRNA表達載體中，構成siRNA的正義與反義鏈，可由各自的啟動子分別轉錄，然后兩條鏈互補結合形成siRNA；也可由載體直接表達小發卡狀RNA(small hairpin RNA,shRNA），載體包含位于RNA聚合酶Ⅲ啟動子和4～5T轉錄終止位點之間的莖環結構序列，轉錄后即可折疊成具有1~4 個U 3 ’ 突出端的莖環結構，在細胞內進一步加工成siRNA。構建載體前通常要通過合成siRNA的方法，尋找高效的siRNA，然后從中挑選符合載體要求的序列，將其引入siRNA表達載體。