植物細胞的脫分化和分化培養

一、實驗原理
分化了的植物根、莖、葉細胞往往具有全能性，在一定條件下進行離體培養，給于一定的營養與激素，可以脫分化為愈傷組織，由愈傷組織制備成細胞懸浮液，在一定的條件下經振蕩培養，逐漸形成具有兩極性的胚狀體，經過進一步的分化培養，給于不同的營養和激素成分，又可以生出完整的小植株。植物的脫分化和分化培養，證明分化了的植物細胞仍具備形成全整植株所需要的全套基因。在一定條件下，活動的基因可以關閉、已關閉的基因又可以重新啟動、再行由胚到成熟植株發育過程中有關基因的先后活動程序。
二、實驗目的
1.通過實驗，掌握無菌操作方法，將胡蘿卜貯藏根培養成為愈傷組織。
2.用無菌操作方法，把煙草組織或甘藍花莖直接培養成分化小植株。
三、實驗材料
胡蘿卜貯藏根每組二根，甘藍花莖或煙草莖每組二根。
四、實驗器具和藥品
每組鋁飯盒3個，大培養皿2套，250毫升燒杯2只，漂白粉過濾液200毫升，70％酒精，酒精棉花，鑷子2把，保安刀2把，小鑷1把，無菌水。
脫分化培養基各組6瓶，30毫升/瓶
分化培養基各組4瓶，30毫升/瓶
MS培養基：每升中含固體培養基：MS液體加0.8％ 瓊脂
脫分化培養：MS培養基加2，4－D2毫克/升
BA0.2毫克/升
分化培養基：1.MS培養基加KT（或BA）2毫克/升
2.MS培養基加KT（或BA）2毫克/升+IAA0.05毫克/升
其中KT為激動素、BA為6-芐基嘌呤、IAA為吲哚乙酸（2種分化培養基，采用一種即可）
五、實驗說明
脫分化培養基和分化培養基的主要區別在于 激素 的成分和含量上，說明各種 激素 的出現和含量改變對于植物組織分化起著重要的作用。許多植物從脫分化到分化過程對培養基里激素成份要求嚴格、有的還要進行液體培養才能重新分化。例如，胡蘿卜貯藏根組織，是最早用于研究植物細胞的全能性的材料，至今仍是研究脫分化的好材料，但當胡蘿卜組織形成愈傷組織之后，若要它們重新分化，必須經過振蕩培養和采用合適的培養基，條件較為復雜。另一些植物，例如煙草的根、莖、葉和甘藍的花莖等容易進行脫分化和分化培養，不需液體振蕩培養可以在固體培養基上直接完成，是兩類較好的實驗材料。
六、實驗步驟
（一）操作前用溫水和肥皂將手充分擦洗干凈，盡量做到不帶菌。
（二）將事先用自來水洗凈的煙草莖，甘藍花莖或胡蘿卜貯藏根切成一定的大小（一般莖、根約為2厘米長、寬）。
（三）完成以上步驟后，又應用70％酒精棉花擦手，以便再行消毒。
（四）用消毒鑷子將根或莖的切段投放到裝有70％酒精的大培養皿中浸泡30秒鐘。
（五）切段自酒精中取出后，立即浸泡于裝有15％漂白粉精片水溶液的大培養皿中達20秒鐘。
（六）以上組織切段經分別裝有無菌水Ⅰ、Ⅱ的鋁飯盒各10分鐘，進行漂洗，最后置于無菌水Ⅲ中達20分鐘以上。
（七）切段自無菌水中取出后，立即放于9厘米滅菌培養皿中，蓋上皿蓋，放于滅菌接種箱。
（八）在滅菌箱中，無菌操作，削去植物莖、根的外部，葉子的邊緣。
（九）把正常部分切成3mm×3mm×1.5mm大小方塊，葉組織切成1.5cm×1.5cm方塊。
（十）由小鑷子和接種針，在無菌條件下，將組織小塊放入盛有脫分化培養基的三角燒瓶中，每瓶放5—6莖，根組織塊或3—4塊葉片組織塊。掛上標簽，寫明日期，組號。
（十一）20℃—25℃避光培養3—4星期后觀察。
（十一）煙草或甘藍的花莖、長成的愈傷組織，可用同樣的無菌操作法，再接種到分化培養基上，3—4星期再進行觀察。
胡蘿卜材料要經過液體培養基振蕩培養，才能分化（本實驗從略）。
七、實驗結果
（一）觀察并記錄接種的脫分化培養的組織細胞有無污染？
（二）愈傷組織細胞是否出現綠色？討論其來源與影響？
（三）煙草組織或甘藍花莖經過分化培養、長出完整的植株，說明什么問題？在理論和實踐中有何價值？