植物病原真菌的分離培養（一）

一、實驗原理

植物患病組織內的真菌菌絲體，如果給予適宜的環境條件，除個別種類外，一般都能恢復生長和繁殖。植物病原菌的分離就是指通過人工培養，從染病植物組織中將病原真菌與其它雜菌相分開，并從寄主植物中分離出來，再將分離到的病原菌于適宜環境內純化，這個過程總稱植物病菌的分離培養。植物病原真菌的分離一般都是采用組織分離法，就是切取小塊病組織，經表面消毒和滅菌水洗過后，移到人工培養基上培養。

二、實驗目的

植物病原菌的分離培養是植物病理學實驗最基本的操作技術之一，它對原害鑒定，病原形態觀察、植物病害接種體的培養等方面都是經常使用的研究手段。通過本實驗，要求植物病原菌分離培養的一般原則和方法。

三、實驗材料及準備

1．分離材料：梨黑斑病（Alternaria kikuchiana），柿樹圓斑病（Pestnlotia sp）及杉木炭疽病（Glomerella cingolata）新發病的病葉；楊樹爛皮病（Cytospora chrysosperma）國槐腐爛病（Dothiorella sp.）的帶有新病斑的枝條；油松種子。

2．分離用具（每小組為單位）

酒精燈4個，手術剪4把，眼科鑷4把，PDA培養基3瓶，培養皿（Φ9cm）24套，小燒杯（5ml）4個，大燒杯1個，斜面培養基12管，滅菌水4瓶，75%酒精瓶1個（內放脫脂棉球）0.1%升汞瓶1個，5%乳酸瓶（60ml）1個，火柴1盒，濕、干紗布各4張。

四、實驗方法及步驟

（一）分離前的準備工作

1．工作環境的清潔和消毒

分離培養一般在無菌室、無菌箱或無菌工作臺（超凈工作臺）上進行，無菌室和無菌箱要經過噴霧除塵，并用藥物或紫外線照射消毒（常用消毒藥物為70%酒精，2%煤酚皂液，5%石炭酸液等噴霧。若用紫外線燈照射則需20-30分鐘）。在沒有上述設備條件時，在清潔房間里關閉門窗，避免空氣流動，經過噴霧除去空氣及地面灰塵后進行操作，也可獲得較好的結果。工作前擦凈桌面，最好鋪上濕紗布。將所需用的物品按次序放在工作臺上，避免工作時走動，工作人員最好穿上滅菌后的工作服，帶上口罩，并用肥皂洗手，用70%酒精或0.1%新潔爾滅擦手。

2．分離用具的消毒

凡是和分離材料接觸的器皿（刀、剪、鑷、針等）都要隨時（至少在使用時）保持無菌，將這些用具浸于70%酒精中，使用時在燈焰上滅菌燒去酒精，如此2-3次（刀、剪、鑷等不宜在燈焰上燒時過長，以防退火）。再次使用時必須重復滅菌。培養皿、試驗等要經過干熱滅菌。培養基及洗滌或稀釋用蒸餾水都需要事先經過高壓蒸氣滅菌。

3．分離材料的選擇

用新發病的植株、器官或組織做為分離材料，可以減少腐生菌的污染。任何植物壞死部分的內部或表面，都可能有腐生微生物的孽生，所以一般斑點病害應從鄰近健全組織，即從病、健組織交界處獲得分離材料。