目的:用于 Northern 雜交、純化 mRNA、RT-PCR 及 DDRT-PCR 等。
材料:植物油嫩組織器官或種子萌發的幼苗。
1、異硫氰酸胍法
(1)試劑
①異硫氰酸胍溶液:4mol/L 二異硫氰酸胍,25mmol/L 檸檬酸鈉(pH7.0),0.5%十二烷基肌氨酸鈉,0.1mol/L 巰基乙醇。
②2mol/L NaAc(pH4.0):用經 DEPC 處理過的水配制,高壓滅菌。
③水飽和苯酚(pH3.5)。
(2)操作
①取兩只50mL 離心管,各加入15mL 異硫氰酸胍溶液,于冰上預冷。
②取5g 新鮮的幼嫩植物組織放在研缽中加入液氮,迅速研磨成均勻的粉末。
③將粉末全部移入冰上預冷的離心管中,振蕩離心管混合均勻,將離心管置冰上。
④加入2mol/L NaAc 1.5mL、水飽和酚15mL 和氯仿/異醇3mL,每加一種試劑都輕輕搖晃離心管混合均勻,最后將離心管蓋緊,倒轉幾次混合均勻,冰浴15min。
⑤4℃條件下15000離心力離心30min,將上層水相轉移至另一干凈的離心管中,向管中加入等體積的異丙醇,混勻,置一20℃冰箱冷凍1h。
⑥4℃條件下13000離心力離心25min,小心去除上清液,沉淀溶于5mL 異硫氰酸胍溶液中(體積為第一次異硫氰酸胍溶液體積的1/3),再加入等體積的異丙醇,混勻后置20℃冰箱冷凍1h。
⑦4℃條件下13000離心力離心20min,沉淀用70%乙醇洗一遍,稍微晾干后,溶于適量體積(約500L)DEPC處理的水中。檢測后分裝,于-70℃低溫條件下保存。
(3)說明
①提取時使用的所有玻璃器皿和離心管都要用0.5%的 DEPC 溶液處理,37℃保溫12h 以上,然后高壓滅菌,槍頭也需高壓滅菌。以下各方法均同。
②該方法操作簡便,同時可做多個樣品,無需長時間氯化銫梯度離心,因此近年來已被許多實驗室采用。
2、苯酚法
(1)試劑
①研磨緩沖液:6%4-氨基水楊酸鹽,1%三異丙基萘硫酸鹽,6%苯酚,50mmol/L Tris·Cl(pH8.4)。
②4mol/L NaAc(pH6.0)。
(2)操作
①取新鮮幼嫩的植物材料1～5g,剪成小塊,立刻放入液氮中貯存,備用。
②研缽及杵用液氮預冷,取出冷凍材料,置研缽中加入液氮研至細粉狀。
③加入研磨緩沖液(1g 材料加2mL),繼續研磨,轉入50mL 離心管中。
④加入約一倍體積的苯酚/氯仿/異戊醇,于冰上使粉末分散均勻,4℃、5000r/min 離心10min。
⑤上清液轉至新離心管中,重復用苯酚/氯仿/異戊醇抽提3次。
⑥將上清液轉入新離心管,加入4mol/L NaAc(pH6.0)至終濃度為0.2mol/L 混勻,然后加入2.5倍體積的冷的乙醇,混勻,4℃條件下 10000r/min 離心10min。小心去上清液,沉淀溶于較小體積的重蒸餾水中。
⑦加入4mol/L NaAc(pH6.0)至3.0mol/L,混勻,置冰上2～3h,然后4℃條件下 10000r/min 離心10～30min。沉淀溶于20～1000μL 的0.2mol/L的 NaAc 中,加入2.5倍體積冷乙醇,4℃、10000r/min 離心10min。
⑧用70%乙醇洗沉淀,真空干燥,溶于 100L 水中,貯于-70℃或液氮中。
(3)說明該方法簡單、經濟,被認為是通用的方法。
3、LiCl沉淀法
(1)試劑
①提取緩沖液:100mmol/L LiCl,100mmol/L Tris·Cl(pH8.0),10mmol/L EDTA,1% SDS。
②4mol/L 及 2mol/L LiCl。
③50mmol/L EDTA。
(2)操作
①根據實驗需要,取0.1～15g 葉片或愈傷組織置液氮中冷凍,研磨成粉。
②加入3～5倍體積80℃預熱的提取緩沖液,混勻。
③加入0.5～1倍體積的氯仿/異戊醇,混勻,4℃、10000離心力離心15min。
④取上相,重復氯仿/異戊醇抽提1次。
⑤取上相,加入1倍體積的4mol/L LiCl,混勻后于4℃沉淀過夜或-20℃放置 3h 以上,沉淀 RNA。
⑥12000離心力離心 30min,去上清液。
⑦沉淀重懸于 2mol/L LiCl 和 50mmol/L EDTA 中,12000離心力離心30min,收集 RNA 沉淀,70%乙醇漂洗,吹干,溶于適量無菌重蒸水中,備用。
(3)說明
①該方法葉片 RNA 的產量可達0.05mg/g,愈傷組織產量可達0.03mg/g。
②對于不同材料及 RNA 的不同用處,在此基本方法上可加以修改:對于鑒定轉化材料的簡單快速提取,可在提取液中加入飽和酚,省去氯仿/異戊醇重復抽提及 2mol/L LiCl 的再次沉淀。
對于富含多糖的植物材料,操作中可采用或合用以下方法去除多糖。
①提取緩沖液提取后,離心上相中加入1/3體積的 5mol/L KAc,冰浴中放置30min。將用 LiCl 得到的沉淀溶于適量蒸餾水,加入0.1倍體積的無水乙醇放置30min。10000離心力離心 10min,取上相,再用2倍體積的無水乙醇沉淀。
③也可使用適量的 3mol/L NaAc(pH5.2)懸浮沉淀,冰浴放置3～5min 后離心收集沉淀。必要時可重復1次。
對于富含多酚類物質的材料,提取緩沖液中可加入2%的 PVP 及 10mmol/L 的半胱氨酸。