植物體內可溶性的測定(福林－酚法)

實驗概要

本文介紹了福林－酚法測定植物體內可溶性蛋白質含量的原理及操作步驟等。

實驗原理

該方法是雙縮脲法的發展，包括兩步反應：

1. 在堿性條件下，蛋白質與銅作用生成蛋白質—銅絡合物。

2.   此絡合物將試劑磷鉬酸—磷鎢酸(FolIn試劑)還原，混合物深藍色(磷鉬藍和磷鎢藍混合物)，顏色深淺與蛋白質含量成正比。此方法操作簡便，靈敏度比雙縮脲法高100倍，定量范圍為5~100μg蛋白質。FolIn試劑顯色反應由酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸引起，因此樣品中若含有酚類、檸檬酸和巰基化合物，均有干擾作用。此方法的缺點是有蛋白質的特異性影響，即不同蛋白質因絡氨酸、色氨酸含量的不同而使顯色強度稍有不同，標準曲線也不是嚴格的直線形式。

主要試劑

1. Na₂WO₄·2H₂O

2. Na₂MoO₄·2H₂O

3. 85%H₃PO₄

4. 濃HCl

5. Li₂SO₄·H₂O

6. 溴水

7. 酚酞指示劑

8. Na₂CO₃

9. NaOH

10. CuSO₄·5H₂O

11. 酒石酸鉀鈉

12. 牛血清白蛋白

所用試劑均為化學純或分析純

主要設備

1. 試管若干

2. 刻度移液管0.5Ml 1支，1Ml 1支，10Ml 1支

3. 定量加樣器

4. 圓底燒瓶

5. 冷凝管1套(帶橡膠管)

6. 微量滴定管

7. 小燒杯

8. 微量進樣器50μl 1支

9. 721分光光度計

10. 恒溫水浴器

11. 研缽

12. 玻棒

13. 離心機

14. 離心管

實驗材料

植物新鮮組織

實驗步驟

1. 試劑的配制

   1) 堿性銅試劑(相當于雙縮脲試劑)的制備首先配制A液：4%碳酸鈉(Na₂CO₃)溶液與 0.2mol/L氫氧化鈉(NaOH)溶液等比例混合(2%Na₂CO₃，0.1Mol NaOH)；B液：1%硫酸銅(CuSO₄·5H₂O)溶液與2%酒石酸鉀鈉溶液等比例混合(0.5%CuSO₄·5H₂O，0.1%酒石酸鉀鈉)。在使用前將A液與B液按50∶1的比例混合即成。此為Folin－酚試劑甲液，此試劑只能使用1天。

酚試劑(相當于Folin試劑)的配備：稱取鎢酸鈉(Na₂WO₄·2H₂O)100g、鉬酸鈉(Na₂MoO₄·2H₂O)25g，加蒸餾水700Ml溶解于1500Ml 的圓底燒瓶中。之后加入85%的H₃PO₄50ml，濃HCl 100ml，安上回流裝置(使用磨口接頭，若用軟木塞或橡皮塞時，就必須用錫鉑紙包起來)，使其慢慢沸騰10H。冷卻后加入硫酸鋰(Li₂SO₄·H₂O)150g，水50ml，溴水2~3滴，不用回流裝置開口煮沸15min，以釋放出過量的溴。待冷卻后稀釋至1000ml，并過濾入棕色瓶中，密閉于冰箱中保存(冷卻后溶液呈黃色，倘若仍呈綠色，須再滴加數滴液體溴，繼續煮沸15min)。使用時用標準NAOH溶液滴定，以酚酞作為指示劑，滴定終點由藍變灰，滴定后算出酸的濃度。使用時大約加水1倍，使最終濃度相當于1Mol/L  H酸，此為FolIn-酚試劑乙液(Folin試劑)。

在測定時要注意，因為酚試劑僅在酸性條件下穩定，但此實驗的反應只在PH值為10的情況下發生，所以當加酚試劑時，必須立即混勻，以便在磷鉬酸—磷鎢酸試劑被破壞前即能發生還原反應，否則會使顯色程度減弱。

   2) 標準蛋白質溶液的配制稱取25mg牛血清白蛋白，溶于100ml蒸餾水中，使最終濃度為250μg/ml。

2. 標準曲線的繪制

    1)  取7支試管，編號后，分別加入0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml標準蛋白質溶液，用蒸餾水補足1Ml，使每管含蛋白量分別為0μg、25μg、50μg、100μg、150μg、200μg、250μg(必要時可做重復)。

   2) 在每支試管中用定量加樣器加入5ml甲液，混勻，于30℃下放置10min。

   3) 在每支試管中噴射加入0.5ml乙液，立即振蕩混勻，在30℃下保溫30min。

   4) 準確到30Min后，以不加標準蛋白試管中的溶液為空白，在500nM下用25px光徑的比色杯對系列標準蛋白溶液進行比色，測定光密度值。

以蛋白濃度為橫坐標，光密度值為縱坐標，繪制標準曲線。

3. 樣品的測定

   1) 樣品的提取：稱取鮮樣0.5g，用5ml蒸餾水或緩沖液研磨提取。

取1.0ml(視蛋白質含量適當稀釋)樣液加入試管中，然后重復步驟2的(2)、(3)、(4)，以標準曲線中的0管為空白，測定吸光值。

   2) 根據吸光值查標準曲線，求出比色液中的蛋白質含量。

4. 結果計算

樣品中蛋白的含量(mg/g)=C×VTV1×FW×1000　　　　　　　　　　

式中C：查標準曲線值(μg)；VT：提取液總體積(ml)；FW：樣品鮮重(g)；V1：測定時加樣量(ml)。

注意事項

還原物質，其他酚類物質及檸檬酸對此反應有干擾。