核酸檢測中涉及PCR污染的預防和處理原則

一、適用范圍：

本原則適用于涉及PCR方法進行食品安全檢測的實驗室

本原則適用于PCR實驗室污染的預防和處理。

二、污染來源：

（1）樣品間的交叉污染：樣品污染主要是由于樣品在運輸、儲存、放置過程中處置不當造成的污染。樣品核酸模板在提取過程中，由于操作不當也會導致樣品間的污染。

（2）試劑的污染：由于操作不當，造成核酸提取、擴增過程中各相關試劑的污染。

（3）PCR擴增產物污染：這是PCR反應中最主要最常見的污染。極微量的PCR產物污染就可造成假陽性。最可能造成PCR產物污染的形式是氣溶膠污染。操作時比較劇烈地搖動反應管、開蓋、反復吹吸樣液都可形成氣溶膠而引起污染。

（4）克隆質粒的污染：在用克隆質粒作陽性對照時，有時會出現克隆質粒的污染。

（5）實驗器具的污染：如移液器的污染等。

三、防止污染的方法：

（1）合理的實驗室分區。實驗室內各工作區的實驗用品，包括移液器等應專用。如有可能，應在裝有紫外燈的層流式工作臺（如生物安全柜、超凈工作臺）內，吸加PCR試劑，工作臺內應放置PCR專業用的微量離心機、一次性手套、各量程的移液器和其他必須物品。

（2）正確的實驗操作：

a.吸加PCR試劑和模板的操作應嚴格按要求進行，吸樣要慢，盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或產生氣溶膠污染。

b.實驗的過程中應勤換手套，在進出不同區域或進行模板操作后，都應及時更換手套。

c.裝有PCR試劑的微量離心管在打開之前應先做瞬時離心（約10s），將管壁及管蓋上的液體甩至管底部，從而減少污染手套或加樣器的機會。開管動作要輕，以防管內液體濺出或形成氣溶膠，造成污染。

d.在同時進行多個PCR反應時，應制備主反應混合液，再分裝至PCR反應管，最后添加樣品核酸模板，以減少單個添加操作繁瑣造成的污染。

（3）實驗器具和試劑：

a.實驗室自己配置的試劑，如去離子水、緩沖液等，在使用之前均應高壓滅菌或過濾除菌。

b.分裝PCR試劑：所有的PCR試劑都應小量分裝，以減少重復取樣次數，并置于-20℃保存，適當時，最好做到專人專用。另外，PCR試劑、PCR反應液應與樣品及PCR產物分開保存，不應放于同一冰盒或冰箱。

c.所有吸頭、反應管等應一次性使用，使用之前，都應經過高壓處理。若條件允許，最好使用帶濾器的槍頭。各工作區內的移液器要有標識，應固定使用用途，不能交叉使用。     

（4）實驗設計方面應遵循實驗室內部質量控制的相關規定，實驗中至少應：

a.設置目標DNA陽性對照反應。對靶序列所作的適當的稀釋工作應于實驗前在實驗室內別的位置進行，這樣可防止將靶DNA的濃溶液帶到實驗室中專門進行PCR的位置。

b. 設置PCR試劑陰性對照和目標DNA陰性對照反應。

四、分析污染原因：

（1）試劑污染：檢測陰陽性對照反應結果。如果陰性對照反應結果為陽性，說明PCR反應體系中某一種或數種試劑被污染。若陽性對照反應為陰性，則說明PCR反應體系中存在抑制物質，或一種至數種PCR反應試劑失效。

（2）環境污染：在排除試劑污染的可能性之后，如果污染情況仍存在，則考慮可能為環境污染。常見的污染源可能為各種實驗表面的污染，包括實驗臺面、儀器設備表面、各種開關或把手等：對于這些污染可用擦拭實驗來查找可疑污染源。其步驟如下：

a.用無菌水浸泡過的無菌棉簽擦拭可疑污染源；

b.0.1mL去離子水浸泡；

c.取5μL做PCR實驗；

d.電泳檢測結果。

如果經過上述追蹤實驗，仍不能查找到確切污染源，則污染可能是由空氣中PCR產物的氣溶膠造成的。

五、污染處理：

（1）環境污染：

a.稀酸處理法：對可以器具用1mol/L鹽酸擦拭或浸泡，使殘余DNA脫嘌呤。

b.紫外照射（UV）法：紫外波長（nm）一般選擇254nm和300nm，照射30min即可。選擇UV作為消除殘留PCR產物污染時，要考慮PCR產物的長度與產物序列中堿基的分布，UV照射僅對500bp以上長片段有效，對短片段效果不大。

c.若可能是氣溶膠污染，應該更換實驗場所，若條件不允許，則重新設計新的引物（與原引物無相關性）。

（2）試劑污染：

若經對照實驗顯示，為試劑造成的污染，應立即更換試劑。