一，朗伯-比爾定律的意義
朗伯-比爾定律是光吸收的基本定律，適用于所有的電磁輻射和所有的吸光物質，包括氣體、固體、液體、分子、原子和離子。比爾-朗伯定律是吸光光度法、比色分析法和光電比色法的定量基礎。光被吸收的量正比于光程中產生光吸收的分子數目。
二，朗伯-比爾定律定義
朗伯-比爾定律：光被透明介質吸收的比例與入射光的強度無關；在光程上每等厚層介質吸收相同比例值的光。
A=lg(1/T)=Kbc
（A為吸光度；T為透射比, 即透射光強度與入射光強度之比；c為吸光物質的濃度,單位mol/L；b為吸收層厚度，單位cm ）
三，朗伯-比耳定律成立的條件
(1) 入射光為平行單色光且垂直照射。
(2) 吸光物質為均勻非散射體系。（必須是透明溶液）
(3) 吸光質點之間無相互作用。
(4) 輻射與物質之間的作用僅限于光吸收，無熒光和光化學現象發生。
四，偏離朗伯-比爾定律的原因
在分光光度分析中，比爾定律是一個有限的定律，其成立條件是待測物為均一的稀溶液、氣體等，無溶質、溶劑及懸濁物引起的散射；入射光為單色平行光。導致偏離朗伯-比爾定律的原因很多，但基本上可分為物理和化學兩個方面。物理方面主要是入射光的單色性不純所造成的；化學方面主要是由于溶液本身化學變化造成的。
(1)單色光不純引起的偏離
嚴格說來，朗伯-比爾定律只適用于單色光。但由于儀器分辯能力所限，入射光實際為一很窄波段的譜帶。由于分光光度計分光系統中的色散元件分光能力差，即在工作波長附近或多或少含有其他雜色光，雜散光(非吸收光)也會對比爾定律產生影響，這些雜色光將導致朗伯-比爾定律的偏離。
實際上，理論上的單色光是不存在的，我們所做的只能是讓入射光的光譜帶寬盡可能的小，要盡可能的靠近單色光。
(2)溶液本身性質引起比爾定律的偏離
1、樣品溶液濃度的影響
比爾定律是一個有限的定律，它只適用于濃度小于0.01mol/L的稀溶液。因為濃度高時，吸光粒子間的平均距離減小，受粒子間電荷分布相互作用的影響，他們的摩爾吸收系數發生改變，導致偏離比爾定律。因此，帶測溶液的濃度應該控制在0.01mol/L以下。
還有人認為：因為當被測物質在溶液中濃度較大時，量子光學認為，吸光粒子的相互作用加強，吸光能力下降；溶液的折光指數(n)隨溶液的濃度改變而變化，并對吸光度有影響。當溶液濃度低于0.01mol/L時，n基本上是一常數，這也說明朗伯-比爾定律只有在低濃度中應用才是正確的。
2、溶質和溶劑的性質
例如，碘在四氯化碳溶液中呈紫色，在乙醇中呈棕色，在四氯化碳溶液中即使含有1%乙醇也會使碘溶液的吸收曲線形狀發生變化。這是由于溶質和溶劑的作用，生色團和助色團也發生相應的變化，使吸收光譜的波長向長波長方向移動或向短波長方向移動，即所謂的藍移和紅移。
3、介質不均勻性
朗伯-比爾定律是適用于均勻、非散射的溶液的一般規律，如果被測試液不均勻，是膠體溶液、乳濁液或懸浮液，則入射光通過溶液后，除了一部分被試液吸收，還會有反射、散射使光損失，導致透光率減小，使透射比減小，使實際測量吸光度增大，使標準曲線偏離直線向吸光度軸彎曲，造成對朗伯-比爾定律的偏離。
所以，在分析條件選擇時，應考慮往樣品溶液的測量體系中加入適量的表面活性劑等來改善溶質的均勻度。
4、溶質的離解、締合、互變異構及化學變化
比爾定律在有化學因素影響時不成立。解離、締合、生成絡合物或溶劑化等會對比爾定律產生偏離。離解是偏離朗伯-比爾定律的主要化學因素。溶液濃度的改變，離解程度也會發生變化，吸光度與濃度的比例關系便發生變化，導致偏離朗伯-比爾定律。
溶液中有色質點的聚合與締合，形成新的化合物或互變異構等化學變化以及某些有色物質在光照下的化學分解、自身的氧化還原、干擾離子和顯色劑的作用等，都對遵守朗伯-比爾定律產生不良影響。
來自出射狹縫的光，其光譜帶寬度大于吸收光譜帶時，則投射在試樣上的光就有非吸收。這不僅會導致靈敏度的下降，而且使校正曲線彎向橫坐標軸，偏離朗伯-比爾定律。非吸收光越強，對測定靈敏度影響就越嚴重。并且隨著被測試樣濃度的增加，非吸收光的影響增大。當吸收很小時，非吸收光的影響可忽略不計。
單色光的影響
嚴格講，朗伯－比耳定律只適用于單色光，但目前用各種方法所得到的入射光實際上都是復合光。由于物質對不同波長的光的吸收程度不同，所以會引起對朗伯比耳定律的偏離。減免方法：盡量使入射光的波長范圍窄。
化學因素的影響
嚴格講，朗伯－比耳定律要求吸光質點間無相互作用。但實際工作中存在相互作用，并且吸光物質濃度越大，相互作用也越大，偏離朗伯－比耳定律的程度也越嚴重，所以吸光分析應在稀溶液中進行。
五，朗伯比爾定律的發展
物質對光吸收的定量關系很早就受到了科學家的注意并進行了研究。皮埃爾·布格（Pierre Bouguer）和約翰·海因里希·朗伯（Johann Heinrich Lambert）分別在1729年和1760年闡明了物質對光的吸收程度和吸收介質厚度之間的關系；1852年奧古斯特·比爾（August Beer）又提出光的吸收程度和吸光物質濃度也具有類似關系，兩者結合起來就得到有關光吸收的基本定律——布格－朗伯－比爾定律，簡稱朗伯－比爾定律。
六，分光光度計的種類與區別
紫外可見分光光度計與可見分光光度計的區別
兩者是測定波長范圍不同，紫外一般用氫燈，測定波長范圍180～350nm,可見一般用鎢燈，測定波長范圍320～1000nm。所謂紫外可見分光光度計也就是說這個儀器可以更換光源，能夠測定吸收峰在紫外和可見光部分的化合物。用紫外分光時一定要用石英比色皿，不能用玻璃比色皿，因為紫外線很難透過玻璃的。
吸光度值一般不超過2，超過2時不顯示是正常現象。因為吸光度是透光率的負對數，吸光度超過2就是說透光率小于1％，低于儀器的檢出限，就不再顯示了。
至于置于如何選擇分光光度計，取決于你測定的波長。