科學家們用細胞系或細菌表達外源蛋白已經有三十多年歷史了，這些技術已經在絕大多數實驗室得到了普及。然而，像新藥開發這樣的應用需要大批量的蛋白，現有的表達體系難以勝任。日前研究人員在Nucleic Acids Research雜志上發表文章，展示了一類新型的重組蛋白表達載體。這種載體可以克服表觀遺傳學沉默，在哺乳動物細胞中表達大批量的重組蛋白。
重組蛋白的產量受到許多因素的影響，包括表達載體的類型，細胞系的質量、壽命和代謝等等。建立穩定的細胞系是表達目的蛋白最基本的第一步。不過除了細胞系和表達載體的屬性，蛋白質產量也會受到表觀遺傳學的影響，這種影響取決于轉基因在宿主細胞基因組上的整合位點。為此，有些質粒嘗試使用容易形成開放性染色質的側翼序列，還有一些質粒靶標宿主的常染色質熱點區域。雖然第二條途徑可以確保長時間的穩定表達，但只能整合一個拷貝的轉基因，這無疑限制了轉基因的表達。
為了最大化哺乳動物細胞的重組蛋白產量，Ludwig Boltzmann癌癥研究所的Emilio Casanova和維也納自然資源和生命科學大學的Renate Kunert決定使用細菌人工染色體（BAC）。（延伸閱讀：Nature子刊：新技術給生物制藥帶來質的飛躍）
BAC載體
小鼠轉基因領域的研究者們多年前就發現，基因組整合位點的染色質環境對質粒表達載體有很大的影響。如果載體整合到不太理想的位點，轉基因就會受到沉默或者被忽略。為了克服這一問題他們開始使用較大的表達載體，比如BAC和酵母人工染色體（YAC）。這些大載體可以容納整個基因座，囊括全部或大多數驅動基因表達的調控元件。“這些大載體整合到小鼠基因組之后不受周圍染色質的影響，能夠實現可靠而且拷貝數依賴的轉基因表達，”Casanova說。“構建轉基因小鼠和轉基因細胞的原理是相通的，我們認為以BAC為基礎的表達載體，可以成為建立重組蛋白生產細胞系的有力工具。”
研究人員將不同的開放性染色質區域、啟動子和基因調控元件組合起來，生成了一系列BAC載體。隨后他們在中國倉鼠卵巢（CHO）細胞系中，測試了這些載體對重組蛋白表達的影響，包括人IgG1 Fc片段（IgG-Fc）、CN54gp140（一種高度糖基化的HIV-1蛋白）和PG9（一種中和性HIV-1抗體）。哺乳動物細胞表達的外源蛋白最接近其天然構象，是生產重組蛋白藥物的理想系統。而CHO細胞是目前基因工程制藥中最常用的表達系統。
研究顯示，在含有Rosa26基因座的BAC載體中，這三種蛋白都得到了持續而且穩定的高水平表達。“我們在CHO細胞中使用鼠源的Rosa26 BAC，結果蛋白質產量得到了顯著提高，”Casanova說。“這種載體的重組蛋白表達水平非常高，只需要分析少量的CHO細胞（20–50）就能篩選到高產量的細胞克隆株。”
“我們將Rosa26 BAC與不同的強啟動子結合，發現這些組合的表現并不一致。由此可見，啟動子和染色質環境的組合是在CHO細胞中實現高水平轉基因表達的關鍵，這也體現了染色質調控的復雜性，”他補充道。
研究人員指出，BAC通過增加基因轉錄來優化蛋白產量。如果蛋白表達的主要限制因素是翻譯、折疊或分泌，那么BAC就不一定能有效提高蛋白質產量。此外，BAC的大小限制了它的轉染效率，當然高蛋白產量和高比例表達細胞可以彌補這一問題。Rosa26 BAC還具有其它位點，可以表達進一步優化終產物的因子，比如糖基化酶或凋亡抑制子。
前景展望
CHO細胞的基因組含有大約一萬個不重疊的BAC，雖然Rosa26 BAC已經獲得了很好的效果，但研究人員還在繼續篩選BAC表達載體，以便在哺乳動物細胞中更好的表達治療性重組蛋白。他們對于在癌癥和肝纖維化中靶標STAT3和STAT5特別感興趣。
“我們的主要目標是使用新策略（比如BAC載體系統）開發表達重組蛋白的細胞系，”文章的共同通訊作者Kunert說。“分析最佳蛋白生產細胞的分子和生物學背景，將會推動治療性蛋白的生產。將我們團隊的技術知識與細胞生物學分析結合起來，對于基礎科學轉化為工業應用是很有幫助的。”
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