1. 分離外周血白細胞
(1)取患者肘靜脈血5ml,EDTA抗凝,2500rpm離心10 min。
(2)小心吸取上層血漿,分裝到3個0.5ml離心管中。
(3)在血細胞中加入3倍體積的溶血液,搖勻,冰浴15 min。
(4)2500rpm離心10 min,棄上清。
(5)加入10ml溶血液,搖勻,冰浴15 min。
(6)3000rpm離心10 min,棄上清。
(7)倒置離心管,去掉殘液。
(8)得白細胞,-80oC凍存。
2. 從白細胞中提取基因組DNA
(1)取白細胞,加4.5ml SE,使勁吹打,混勻。
(2)沿管壁加入0.5ml的10%SDS。
(3)加蛋白酶E 50μl/管。
(4)首尾輕搖10 min,混勻。
(5)37oC水浴過夜。
(6)第二天取出,沿管壁加3 ml飽和NaCL,迅速手搖15秒,使蛋白變性析出。
(7)4000rpm離心10 min。
(8)取出上清,放于另一管中,加入等體積的三氯甲烷,混勻15 min。
(9)2500rpm離心10 min。
(10)取出上清,加入等體積的三氯甲烷,混勻10 min。
(11)2500rpm離心10 min。
(12)取上清,轉入50ml管中,加3倍體積無水乙醇。
(13)首尾輕搖,見DNA絮狀沉淀析出。
(14)將DNA挑至管壁,75%乙醇洗滌2遍。
(15)將DNA挑至0.5ml管中,凍干。
(16)加TE 300μl,使DNA溶解,4oC保存。