作者：徐華1，葉世輝1，王寶燕2，劉孟黎1，吳大洲1，賀晨1 作者單位：(1. 陜西省血液中心血型研究室，陜西西安710061;2. 西安交通大學醫學院第一附屬醫院輸血科，陜西西安710061) 【摘要】 目的建立一種可靠的PCR方法，用于RHD血型基因型的研究。方法根據RHD血型基因的特點，設計針對不同RHD基因型的特異性引物，建立多重PCR方法，并與商用試劑盒進行對比。結果本研究所建立的用于鑒定RHD血型基因型的多重PCR方法，與商用試劑盒具有相同的試驗結果。結論本研究建立的多重PCR方法具有簡便、準確和經濟的特點，可以用于RHD基因分型。 【關鍵詞】 多重PCR;RHD血型基因型;RHD基因分型;DEL血型 ABSTRACT: ObjectiveTo establish a reliable PCR method for RHD genotypes research.MethodsBased on the characteristics of RHD gene, the specific primers were designed for different RHD genotypes to establish the multiplex PCR and compare it with commercially supplied RHD genotyping kit. ResultsThe multiplex PCR utilized for RHD genotypes was established. The results of RHD genotypes were the same between the multiplex PCR method and commercially supplied kit.ConclusionThe method of the multiplex PCR can be utilized for the study of RHD genotypes because it is convenient, accurate and economical. KEY WORDS: multiplex PCR; RHD genotype; RHD genotyping; DEL blood group 近年來，研究發現一些血清學初檢RHD陰性的個體經過進一步的檢驗，可以檢出D抗原和D基因。通過進一步的研究，又可以分為部分D(partrial-D)和弱表現型D(weak-D)兩種類型;這些特殊RHD血型的發現，對更加科學地指導安全輸血工作和新生兒溶血病的實驗診斷，都有非常重要的意義[1]。目前， RHD血型的鑒定主要依賴于血清學實驗。但是，血清學的方法很難檢出一些特殊的RHD血型;應用分子生物學的方法鑒定RHD血型具有鑒定準確，可以發現一些特殊的RHD血型，但市售RHD基因分型試劑盒存在價格昂貴、操作復雜等缺點。為了提供一種經濟、簡便和直觀的分子生物學方法，我們開展了多重PCR方法鑒定RHD血型基因型的研究。 1材料與方法 1.1材料DNA標本取自西安市無償獻血者EDTA抗凝全血樣本，經血檢科初步篩選分為RhD陽性和RhD陰性，用Promega全血DNA提取試劑盒提取基因組DNA，DNA濃度為50～150mg/L，-20℃凍存備用;標準質控對照為德國INNO-TRAIN公司出品，分別為D/d型和d/d型樣本。 1.2多重PCR的引物設計多重PCR引物是利用人類不同的RHD基因型的特異性序列位點的改變，設計多對引物，其中引物對①的 DEL-f1和DEL-r1分別為特異性擴增位于第9外顯子的DEL基因的上下游引物，DEL-f1最末堿基針對DEL血型1227位發生G>A的突變而設計[2-3]，DEL-r1位于第9、10外顯子之間的內含子中，擴增片斷長度為102bp;引物對②的Dc-f1和Dc-r1分別為擴增位于RHD和RHCE基因第8外顯子的上下游引物，作為內對照使用，擴增片斷長度為206bp;引物對③的RhD-f1和RhD-r1分別為特異性擴增位于第10外顯子的RHD基因的上下游引物，其中RhD-f1位于第9、10外顯子之間的內含子中，無序列特異性，RhD-r1位于RHD基因第10外顯子中，與同位置RHCE基因有11個堿基差異，具有序列特異性，擴增片斷長度為261bp;引物對④的Dneg-f1和Dneg-r1分別為特異性擴增雜合的Rh盒子基因的上下游引物，其中Dneg-f1位于上游Rh盒子基因內，在下游Rh盒子基因無相同序列，Dneg-r1位于下游Rh盒子基因內，在上游Rh盒子基因無相同序列，擴增片斷長度為1921bp(圖1、表1)。圖1RHD基因型檢測引物設計原理圖Fig.1 The principle of primer designing for RHD genotyping表1RHD基因型檢測引物序列 1.3PCR反應條件PCR儀為PE 9700(美國，AB公司);Taq酶購自上海PROMEGA公司;dNTP購自北京鼎國生物技術有限公司;在100μL的Ependoff管內加入12.8μL PCR緩沖液、2.0μL引物混合物、2.0μL dNTP混合物、0.2μL Taq DNA聚合酶和3.0μL模板DNA，總體系為20μL，充分混合;PCR反應條件為：94℃變性5min，然后進行35個循環的PCR反應(94℃ 40s，56℃ 40s和72℃ 2min)，隨后72℃延伸5min，4℃保存;40g/L瓊脂糖凝膠電泳(200V，20min)，紫外燈下觀察結果并拍照。
1.4驗證本方法的準確性對照的RHD基因檢測試劑盒分別購自德國INNO-TRAIN公司和天津市秀鵬生物技術開發有限公司，按照試劑盒的實驗方法進行操作，以結果的格局圖來判斷結果。