并發轉導與基因定位——三點雜交實驗

本實驗用噬菌體P22對鼠傷寒沙門氏菌進行并發轉導(共轉導),供體細菌中的兩個連鎖基因可被導入受體細菌中,與受體細菌中的一個可選擇表型的基因進行三點雜交分析,用以確定這三個基因的排列順序。

若有三個基因,其野生型分別用A、B、C表示,相應的突變型基因分別記為a、b、c。若A、B、C三個基因的排列如圖32-1所示,即B基因在A基因和C基因之間,供體基因型為aBC,受體基因型為Abc,經轉導選擇C表型。在C轉導子中A和B兩基因的組合有如下四種:①Ab,DNA鏈之間發生兩次交換;②AB,同樣是DNA鏈之間發生兩次交換的結果;③aB,也是DNA鏈之間發生兩次交換的結果;④ab,是DNA鏈之間發生四次交換的結果。根據四次交換少于二次交換這一原理,再檢測ab型轉導子出現的頻率,如果ab型轉導子頻率很低,接近于0,則上述推測的基因排列順序是正確的。同理,如果A基因在B基因和C基因之間,AB轉導子頻率接近于0;若C基因在A和B的中間,這四種類型轉導子的頻率都不可能接近于0。

鼠傷寒沙門氏菌鼠傷寒沙門氏菌噬菌體: P22

LB培養液LB固體培養基補加四環素和卡那霉素LB固體培養基補加四環素NCE-甘露糖固體培養基肉湯培養基NCE培養基

恒溫搖床恒溫培養箱離心機高壓滅菌鍋離心管試管培養皿

(一)將TT12399的Mini-Tn10d-tet引入TT13976

1.挑取供體菌TT12399單菌落接種于5mlLB液的試管中,置37℃振蕩培養過夜,取1ml過夜培養物加到5mlP22肉湯中,37℃振蕩培養8～16h。經4000r/min離心10min,收集上清液即為TT12399的P22裂解液。

2.接種TT13976于LB培養液,37℃振蕩培養過夜。

3.取0.1mlTT13976的過夜培養物和0.1ml適當稀釋的P22裂解液進行混合,然后涂布在LB(Tet)平板上,置37℃培養過夜。

4.挑取在LB(Tet)平板上的單菌落進行分離純化,選擇不含噬菌體的菌株作為三點雜交的供體菌。

(二)三點雜交

1.按常規制備上述供體的P22裂解液。

2.接種受體菌TT10251于LB培養液中,30℃振蕩培養過夜。

3.取0.1mlTT10251的過夜培養物和0.1ml適當稀釋的供體菌株P22裂解液,混合后涂布在LB(Tet)平板上,置30℃培養過夜。

(三)轉導子基因型的測定

1.在上述LB(Tet)平板上生長的菌落為四環素抗性轉導子。用無菌牙簽將這些菌落逐個挑取分別點種在LB平板上(挑200個菌落),置30℃培養過夜。

2.以上述平板菌落長出后作為母平板,將其分別影印在NCE(Man-Tet)和LB(Tet-Kan)平板上,置30℃培養24～48h。

3.對比觀察NCE(Man-Tet)和LB(Tet-Kan)平板上菌落的生長情況。

4.記錄四種表型組合KansMan^-,KansMan⁺,KanrMan^-和KanrMan⁺的轉導子數,并計算各表型組合出現的百分比。

5.確定zxx1900::Tn10d-tet、add和pmi三個基因的排列順序。

受體菌TT10251培養溫度保持在30℃。因為MudA插入突變體pmi::MudA在37℃不穩定。

試劑補充說明：

LB培養液,LB固體培養基補加四環素(終濃度為20μg/ml)(以下簡稱LB/Tet),LB固體培養基補加四環素(終濃度為20μg/ml)和卡那霉素(終濃度為50μg/ml)(以下簡稱LB/Tet/Kan),NCE-甘露糖固體培養基(甘露糖濃度為0.5%,補加四環素終濃度為10μg/ml),肉湯培養基,NCE培養基(每1000ml 50×NCE含:KH₂PO₄ 197g,K₂HPO₄·H₂O 325.1g,Na(NH₄)HPO₄·H₂O 175g,H₂O 925ml)。

配制NCE培養液時,用蒸餾水將50×NCE稀釋成1×NCE,每800ml 1×NCE培養液加1mol/L MgSO₄,再補加碳源。配制NCE固體培養基時,用蒸餾水將50×NCE稀釋成2×NCE,并配制等體積的2.6%瓊脂粉,分別滅菌后混合,補加MgSO₄、碳源和其他所需營養組分,倒平板。