常見發光免疫分析技術的比較

      免疫學技術的迅速發展對精度的要求越來越高，一般的酶免檢測技術已逐漸無法適應這種形勢的需要。現今發展的主流已不再是用放射性同位素標記的測定方法(避免污染環境及對人體損害)，而是轉向于能在任何地方操作的快速均相和固相測定，最終趨向于能夠槍測到皮克或10負18摩爾級的、非同位素的、自動或半自動的實驗室測定技術，發光免疫分析技術順應了這一潮流，開創了免疫診斷的新紀元。

       發光免疫分析是一種靈敏度高、特異性強、檢測快速及無放射危害的分析技術。70年代末以來得到了迅速發展，目前在國際上已經實現商品化和產業化的發光免疫分析產品，基本上可以分為：化學發光、時間分辨熒光(也稱時間延遲光致發光)、電化學發光(也稱場致發光和電致發光)幾種。

       1、化學發光

       化學發光是指在化學反應過程中發出可見光的現象。通常是指有些化合物不經紫外光或可見光照射，通過吸收化學能(主要為氧化還原反應)，從基態激發至激發態。退激時通過躍遷(或將激發能轉移至受體分子上)，釋放能量產生光子，以光形式放出能量從而導致的發光現象。其主要特點為消耗發光劑。同時量子效率相對較低。

       1.1 按化學反應類型分類：可分為酶促化學發光和非酶促化學發光兩類。其中酶促化學發光主要包括辣根過氧化物酶(HRP)系統、堿性磷酸酶 (ALP)系統、黃嘌呤氧化酶系統等。酶促發光的共同特點為發光過程中作為標記物的酶基本不被消耗，而反應體系中發光劑充分過最，因此發光信號強而穩定，且發光時間較長。因此可采用速率法測量，故檢測方式簡單、成本較低。酶促反應的主要缺點為工作曲線可能隨時間漂移，而且低端斜率容易呈非線性下移。而非酶促化學發光包括吖啶酯系統、草酸酯系統、三價鐵一魯米諾系統等。非酶促發光的共同特點為發光過程中標記物被消耗，同時作為標記物的發光劑是發光反應的瓶頸，即含量總是相對不足，因此發光信號持續時間較短；如果直接在免疫反應杯中啟動發光反應，由于發光劑被很快消耗，故只能進行一次性測量。所以重復性較差。為降低檢測成本并實現重復測量，目前普遍采用原位進樣加流動池的時間積分測量方式。因此儀器成本及維護費用較高，而且反復使用的流動池可能導致交叉污染；并目沖洗或進樣中產生的氣泡也會干擾測定；同時繁瑣冗長的沖洗過程也會成為提高檢測效率的瓶頸。另外，使用磁性或非磁性微粒時，強烈的散射吸收作用也會降低靈敏度。

       1.2 按發光持續時間分類：可分為閃光和輝光兩類，閃光型發光時間在數秒內，如吖啶酯系統。其檢測方式一般采用原位進樣和時間積分法測量，即在檢測器部位加裝進樣器，并保證加入發光劑和檢測2個過程同步進行；同時以整個發光信號峰的面積為發光強度。而輝光型發光時間在數分鐘至數十分鐘以上，如HRP一魯米諾系統、ALP—AMPPD系統、黃嘌呤氧化酶-魯米諾系統等。其信號檢測無需原位進樣，一般以速率法測量，即在發光信號相對穩定的區域任意點測量單位時間的發光強度。

       測量化學發光反應的光強度，求得某些化學物質和生物物質的含量，尤其與免疫學方法結合以后形成的化學發光免疫測定法(CLIA)，其既具有發光檢測的高度靈敏性，又具有免疫分析的高度特異性，檢測快速，試劑無放射危害，檢測限達10負15 mol／L。

       1.3 評價：化學發光標記物已廣泛應用于抗原、半抗原和抗體的檢測，與放射性核素標記物相比較，它的優點在于安全(無放射危害)、穩定、測量快速、靈敏度高、線性范圍寬、自動化程度高、減少了人為的誤差。檢測快速縮短了等待結果的時間，無需批量檢測可隨到隨測保證及時提供結果。缺點在于一般化學發光是標記催化酶或化學發光分子的發光反應，一般發光不穩定，為問斷的、閃爍性發光，而且在反應過程中易發生裂變，導致反應結果不穩定。此外。檢測時需對結合相、游離相進行分離，操作步驟多，測試成本高。主要問題是化學發光的產生通常是瞬間完成的，發光的峰值很快衰減，再是本底較高和干擾妨礙應用。

       1.4 代表儀器

       1.4.1 美國拜耳公司最新診斷產品——ACS：180系列全自動化學發光免疫分析系統，以吖啶酯作為標記，量度AE標記物化學反應所產生的光量為基礎，靈敏度可達10負15 g／mL。

       1.4.2 美國雅培公司生產的AxSYM系列全自動免疫發光分析儀將3種技術于一機，可用于非均相標記微粒子酶免發光分析(MEIA)、離子捕捉發光分析(ICIA)和均相標記熒光偏振免疫發光技術(FPIA)，目前已有80多個檢測項目可供臨床應用。