生工引物:
①H-AP1(2uM): 5’-AAGCTTCATTCCG-3’
②H-AP2(2uM): 5’-AAGCTTCCACGTA-3’
③H-AP3(2uM): 5’-AAGCTTCGGGTAA-3’
④H-AP4(2uM): 5’-AAGCTTGAGTGCT-3’
⑤H-AP5(2uM): 5’-AAGCTTCGGCATA-3’
⑥H-AP6(2uM): 5’-AAGCTTGGAGCTT-3’
⑦H-AP7(2uM): 5’-AAGCTTACGCAAC-3’
⑧H-AP8(2uM): 5’-AAGCTTTAGAGCG-3’
特異引物:
①5ac: 5’-GAGTTTCCACCATGGTGT-3’
②ck5: 5’- GGAGTGAGTTTCCACCAT-3’
③10ac: 5’-TTGTTGTAGGGGTGAGTT-3’
④10acb: 5’-CATGGTATATGTGATGGA-3’
⑤2ben: 5’- GTTGTGGGCACAAGATTC-3’
⑥3ben:5’- CATAGTGTATGTGATGGA-3’
⑦Phen:5’-GGTAGTGCATGCGATGCA-3’
二、 實驗方法
2. 總RNA的提取與檢測
(1)用品的準備
塑料器皿,如離心管、Tip頭等用0.1%的DEPC水37℃浸泡12小時以上,高壓滅菌并烘干后使用;所用溶液用0.1%的DEPC水37℃浸泡12小時以上,高壓滅菌后4℃保存;玻璃器皿經180℃烘烤12小時以上,冷卻備用。
(2)試劑的配置
① CSB緩沖液
42 mmol/L 檸檬酸鈉(Sodum citrate)
0.83%(W/V)十二烷基肌氨酸鈉(N-lauryl sarcosine)
0.2 mmol/L 巰基乙醇(β-mercaptoethanol)(使用前加入)
(3)RNA提取
對懸浮培養細胞A、B進行RNA提取,提取步驟如下:
① 50 ml 離心管中加入10 ml 變性勻漿液,冰浴5分鐘。
② 取0.5 g 細胞在液氮中研磨至粉末,轉移至預冷的變性勻漿液中,加200 ul β-巰基乙醇,振蕩混勻。
③迅速加入1 ml 2 mol/L 乙酸鈉(pH4.0),充分混合。
④ 加入10 ml 水飽和酚,劇烈振蕩10~15秒,在冰上放置5分鐘。
⑤ 加入2 ml 氯仿:異戊醇(24:1),劇烈振蕩10~15秒,在冰上放置15分鐘。
⑥ 4℃,12 000 g,離心20分鐘。
⑦ 小心移取上層水相,棄去中間相和下層有機相。
⑧ 加入6 ml 水飽和酚,劇烈振蕩10~15秒,在冰上放置5分鐘。
⑨ 加入6 ml 氯仿:異戊醇(24:1),劇烈振蕩10~15秒,在冰上放置15分鐘