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  • 發布時間:2020-06-22 14:39 原文鏈接: 差示反轉錄PCR實驗(二)

    生工引物:

    ①H-AP1(2uM): 5’-AAGCTTCATTCCG-3’

    ②H-AP2(2uM): 5’-AAGCTTCCACGTA-3’

    ③H-AP3(2uM): 5’-AAGCTTCGGGTAA-3’

    ④H-AP4(2uM): 5’-AAGCTTGAGTGCT-3’

    ⑤H-AP5(2uM): 5’-AAGCTTCGGCATA-3’

    ⑥H-AP6(2uM): 5’-AAGCTTGGAGCTT-3’

    ⑦H-AP7(2uM): 5’-AAGCTTACGCAAC-3’

    ⑧H-AP8(2uM): 5’-AAGCTTTAGAGCG-3’

     

    特異引物:

    ①5ac: 5’-GAGTTTCCACCATGGTGT-3’

    ②ck5: 5’- GGAGTGAGTTTCCACCAT-3’

    ③10ac: 5’-TTGTTGTAGGGGTGAGTT-3’

    ④10acb: 5’-CATGGTATATGTGATGGA-3’

    ⑤2ben: 5’- GTTGTGGGCACAAGATTC-3’

    ⑥3ben:5’- CATAGTGTATGTGATGGA-3’

    ⑦Phen:5’-GGTAGTGCATGCGATGCA-3’

     

    二、 實驗方法

     

    2.  總RNA的提取與檢測

     

    (1)用品的準備

     

    塑料器皿,如離心管、Tip頭等用0.1%的DEPC水37℃浸泡12小時以上,高壓滅菌并烘干后使用;所用溶液用0.1%的DEPC水37℃浸泡12小時以上,高壓滅菌后4℃保存;玻璃器皿經180℃烘烤12小時以上,冷卻備用。

     

    (2)試劑的配置

     

    ① CSB緩沖液

     

    42 mmol/L 檸檬酸鈉(Sodum citrate)

     

    0.83%(W/V)十二烷基肌氨酸鈉(N-lauryl sarcosine)

     

    0.2 mmol/L 巰基乙醇(β-mercaptoethanol)(使用前加入)

     

    (3)RNA提取

     

    對懸浮培養細胞A、B進行RNA提取,提取步驟如下:

     

    ① 50 ml 離心管中加入10 ml 變性勻漿液,冰浴5分鐘。

     

    ② 取0.5 g 細胞在液氮中研磨至粉末,轉移至預冷的變性勻漿液中,加200 ul β-巰基乙醇,振蕩混勻。

     

    ③迅速加入1 ml 2 mol/L 乙酸鈉(pH4.0),充分混合。

     

    ④  加入10 ml 水飽和酚,劇烈振蕩10~15秒,在冰上放置5分鐘。

     

    ⑤ 加入2 ml 氯仿:異戊醇(24:1),劇烈振蕩10~15秒,在冰上放置15分鐘。

     

    ⑥ 4℃,12 000 g,離心20分鐘。

     

    ⑦ 小心移取上層水相,棄去中間相和下層有機相。

     

    ⑧ 加入6 ml 水飽和酚,劇烈振蕩10~15秒,在冰上放置5分鐘。

     

    ⑨ 加入6 ml 氯仿:異戊醇(24:1),劇烈振蕩10~15秒,在冰上放置15分鐘


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