工程菌高密度發酵操作流程

基本原理

    發酵工業是既古老又嶄新的工業，它的形成經歷了漫長的歲月。隨著科學技術的發展，發酵工業不斷地得到發展和充實。現代發酵工業就是傳統的發酵技術與現代DNA重組、細胞融合等新技術相結合，而發展起來的現代生物技術，并通過現代化學工程技術生產有用物質或直接用于工業化生產的一種大工業體系，是生物技術的重要組成部分。

    發酵工業在基因工程藥物的研制方面起著不可替代的作用。重組DNA技術和大規模培養技術的有機結合，使得原來無法大量獲得的天然蛋白特別是基因工程藥物能夠大量生產，應用于臨床的基因工程藥物的市場正以每年5~15%的速度增長。采用高密度發酵技術，可以提高菌體的密度，最終提高產物的比生產率（單位體積單位時間內產物的產量）不僅可以減少培養體積、強化下游分離提取，還可以縮短生產周期，減少設備投資從而降低生產成本，提高市場競爭力。

    發酵工程菌除有高濃度、高產量、高產率外還應該滿足：能利用易得的廉價原料；不致病，不產生內毒素；容易進行代謝調控；易于進行DNA重組技術。目前應用最多的是大腸桿菌（遺傳背景清楚、操作簡便、培養條件容易控制、成本低）。

    工程菌生長繁殖需要的條件是：良好的物理環境--發酵溫度、pH值、溶氧量等；合適的化學環境--適宜工程菌生長代謝所需的各種營養物質的濃度，并限制阻礙生長代謝的有害物質的濃度。在發酵過程中許多控制參數對工程菌的生長構成影響，需不斷加以調整（見下表），從而達到優化控制目的。

    發酵工藝分為批式發酵、流加式培養（Fed-batch）和程控發酵

試劑的配制

1. 種子液(1000ml, pH7.0)： 

Trypton        16g

Yeast Extract  10g

Glycerol       20ml

NaCl            5g

2. 發酵液（600ml）：      

Trypton            50g

Yeast Extract       50g

Glycerol           100ml

MgSO4·7H2O          3g

3. 補料（2400ml）：       

Trypton            200g

Yeast Extract      100g

Glycerol           1000ml

MgSO4·7H2O         12g

4. 鹽（1000ml,pH7.2）：    

KH2PO4            20g

K2HPO4            40g

Na2HPO4·12H4O    70g

(NH4)2SO4         12g

NH4Cl             0.2g

儀器

Biostat 5L自動發酵罐，德國B.Braun公司。

操作步驟

1.消毒所有試劑、管路等。

2.發酵罐消毒。

3.發酵用菌種篩選  取-70℃保存的甘油菌種劃平板，37℃培養過夜，挑取單菌落于5ml試管中，振蕩培養至A6000.6左右，按20ml/L接種于含種子液的500ml搖瓶中，振蕩培養至對數中期，作為發酵罐的種子液。

以上環節應該在實驗進行前準備好。

4.打開儀器，調節相應的參數。

5.在發酵罐中加入發酵液、鹽。

6.將種子液按40ml/L接種至發酵罐，控制適當范圍的參數：溶氧為≥30%；溫度為37℃；pH值設定為7.0，流加300ml/L的氨水以保持恒定。

7.當發酵密度到一定范圍的時候（溶氧開始上升）。

8.誘導目的蛋白表達。

9.收集菌體

10.清洗發酵罐，關閉儀器。