實用哺乳動物細胞培養手冊（一）

細胞培養所用玻璃及塑料制品的清洗與消毒

清洗

在組織細胞培養中，體外細胞對任何有害物質都非常敏感。微生物產品附帶雜物，上次細胞殘留物及非營養成分的化學物質，均能影響培養細胞的生長。因此對新使用玻璃器 皿和重新使用的培養器皿都要嚴格徹底的清洗，且要根據器皿的組成材料不同，選擇不同 的清洗方法。

玻璃器皿的清洗

組織細胞培養中，使用量最大的是玻璃器皿，故工作最最大的是玻璃器皿的清洗。一般玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸酸和沖洗四個步驟。清洗后的玻璃器皿不僅要求干凈透明無油跡，而且不能殘留任何物質。

（1）浸泡：初次使用和培養使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附著物軟化或被 溶液掉。新的初次使用的玻璃器皿，在生產及運輸過程中，玻璃表面帶有大量的干固的灰塵，且玻璃表面常呈堿性及帶有一些對細胞有害的物質等。新瓶使用前應先用自來水簡單刷洗，然后用稀鹽酸液浸泡過夜，以中和其中的堿性物質。再次使用的玻璃器皿則常附有 大量剛使用過的蛋白質，干固后不易洗掉，故用后要立即浸入水中，且要求完全浸入，不 能留有氣泡或浮在液面上。

（2）刷洗：浸泡后的玻璃器皿一般要用毛刷沾洗滌劑刷洗，以除去器皿表面附著較牢的 雜質。刷洗要適度，過度會損害器皿表面光澤度。

（3）浸酸：清潔液是由重鉻酸鉀、濃硫酸和蒸餾水按一定比例配制而成，其處理過程稱為浸酸。清潔液對玻璃器皿無腐蝕作用，而其強氧化作用可除掉刷洗不掉的微量雜質。清 潔液去污能力很強。是清洗過程中關鍵的一環。浸泡時器皿要充滿清潔液，勿留氣泡或器 皿露出清潔液面。浸泡時間一般為過夜，不應少于 6 小時。 清潔液可根據需要，配制成 不同的強度，常用的下列三種： 重鉻酸鉀（g）濃硫酸（ml）蒸餾水（ml）（A）強 清潔液 63∶1000∶200000（B）次強清洗液 120∶200∶1000（C）弱清潔液 100∶100∶100。

清潔液配制時應注意安全，須穿戴耐酸手套和圍裙，并要保護好面部及身體裸露部分。配制過程中可使重鉻酸鉀溶于水中，然后慢慢加濃硫酸。并不停的用玻璃棒攪拌，使產生的熱量揮發，配制過程中可使重鉻酸鉀溶于水中，然后慢慢加濃硫酸。并不停的用玻璃棒 攪拌，使產生的熱量揮發，配制溶液應選擇塑料制品。配成后清潔液一般為棕紅色。

（4）沖洗：玻璃器皿在使用后，刷洗及浸泡后都必須用水充分沖洗。使之盡量不留污染或潔液的殘跡。沖洗最好用洗滌裝置。即省力、效果又好。如用手工操作，則需流水沖洗十次以上，每天水須灌滿及倒干凈，最好用蒸餾水清洗 3-5 次，晾干備用。

膠塞的清洗

細胞培養中所用的橡膠制品主要是瓶塞。新購置的瓶塞帶有大量滑石粉及雜質，應先 用自來水沖洗，再做常規處理，常規清洗方法是：每次用后立即置入水中浸泡，然后用2% NaOH 或洗衣粉煮沸 10-20 分鐘，以除掉培養中的蛋白質。自來水沖洗后，再用 1% 稀 鹽酸浸泡 30 分鐘或蒸餾水沖洗后再煮沸 10-20 分鐘，晾干備用。

塑料制品的清洗塑料自制品現多是采用無毒并已經特殊處理的包裝，打開包裝即可用，多為一次性物品。必要時用 2% NaOH 浸泡過夜，用自來水充分沖洗，再用 5% 鹽酸溶液浸泡 30 分鐘， 最后用自來水和蒸餾水沖洗干凈，晾干備用。

消毒

細胞培養的最大危險是發生培養物的細菌，真菌和病毒等微生物的污染。污染主要是 由于操作者的疏忽而引起，常見的原因有操作間或周圍空間的不潔，培養器皿和培養液消毒不合格或不徹底。由于有關培養的每個環節的失誤均能導致培養失敗，故細胞培養的每個環節都應嚴格遵守操作常規，防止發生污染。 消毒方法分為三類：物理滅菌法（紫外線、濕熱、干烤、過濾等），化學滅菌法（各種化 學消毒劑）和抗生素。

（1）紫外線消毒：用于空氣，操作臺表面和不能使用其它法進行消毒和培養器皿。紫外線 直接照射方便、效果好，經一定的時間照射后，可以消滅空氣中大部分細菌，培養室紫外 線燈應距地面不超過 2.5 米，且消毒進物品不宜相互遮檔，照射不到的地方起不到消毒作 用。紫外線可產生臭氧，污染空氣，試劑及培養液都有不良影響，對人皮膚也有傷害，不 宜近照射。

（2）溫熱消毒：即高壓蒸氣消毒，是一種使用最廣泛、效果最好的消毒方法。溫熱消毒時， 消毒物品不能裝得過滿，以防止消毒器內氣體阻塞而千百萬危險，保證其內氣體的流通。 在加熱升壓之前，先要打開排氣閥門排放消毒器內的冷空氣，冷氣空氣排出后，關閉排氣 閥門，同時檢驗安全閥活動自如，繼后開始升壓，當達到所需壓力時，開始記算消毒時間。 消毒過程中，操作者不能離開工作崗位，要定時檢查壓力及安全，防止消毒及表皮意外事 件發生。

常用物品消毒壓力及時間：

培養液、平衡鹽溶液及其它需要滅菌的液體：121℃, 15 磅, 20 分鐘；

布類、玻璃制品、金屬器械等物品：先 121℃, 15 磅, 20 分鐘，然后在烘箱中烘干；

玻璃瓶：干熱滅菌 170℃, 4 小時。

（3）化學消毒法：最常見的是 70% 酒精及 1‰ 的新潔而滅，前者主要用于操作者的皮膚， 操作臺表面及無菌室內的壁面處理。后者則主要用器械的浸泡及皮膚和操作室壁面的擦試消 毒。化學消毒法操作簡單、方便有效。

（4）抗生素消毒：主要用于培養用液滅菌或預防培養物污染。

細胞培養常用物品

細胞培養基

目前，市場上可提供干粉培養基和液體培養基。干粉培養基需使用者自己配制并滅菌，其優點是價格便宜。缺點是配制過程繁瑣，質量不易控制。液體培養基是由專業產家按標準規模化生產，不僅質量得到保證，而且使用十分方便。

血清（略）

平衡鹽液體

PBS（Phosphate-Buffered Sallines）

DPBS（Dulbecco’s Phosphate-Buffered Sallines）標準型

Hanks’ 平衡鹽溶液（Hanks’ Balanced Salt Solutions，HBSS）

D-Hanks’ 平衡鹽溶液 (D-Hanks Balanced Salt Solutions, D-HBSS)