定量蛋白數>1000個！血液樣本DIA技術“質”的提升

　　傳統的蛋白質組技術，如iTRAQ、TMT或者label-free等，采用的是DDA（data-dependent acquisition，數據依賴采集）數據采集方式，其策略是對響應最高的部分母離子進行二級采集。而新一代的蛋白質組學技術DIA（Data Independent Acquisition，數據非依賴采集）采用了不同的數據采集模式：將質譜整個全掃描范圍分為若干個窗口，然后對每個窗口中的所有離子進行檢測、碎裂，從而無遺漏、無差異地獲得樣本中所有離子的信息，實現了從傳統的機槍掃射的方式向導彈轟炸方式的采集方式轉變。

　　DIA（Data Independent Acquisition，數據非依賴采集）作為新一代的蛋白質組學技術，憑借其導彈轟炸式的全掃描數據采集方式，顯著提升了蛋白質組學分析的覆蓋度、重現性和準確性，已被眾多頂級研究應用，并發表于Cell、Science、Nature Medicine、Circulation等雜志。更重要的是，DIA已經應用于眾多國家級的精準醫療項目，如“癌癥登月計劃”、“蘇黎世癌癥地圖”、“ProCan項目”等。

　　上海中科新生命經過長期的潛心研發，已在血液樣本蛋白質組學分析方面實現新突破：基于DIA技術，在常規2h分析時長、無需去除血液高豐度蛋白、無需分級的情況下，實現了單個樣本定量>1000個蛋白！！！其中線性范圍跨越5-6個數量級。該分析能力，比相同分析條件下的傳統蛋白質組分析技術（如iTRAQ、TMT或label-free）的數據量提升不止2倍，也使得服務行業中DIA技術在分析能力方面有了質的提升!

　　中科新生命本次在血液蛋白質組學上的技術突破獲得了行業內的廣泛關注，也非常希望同對DIA技術感興趣的老師與同行，進行廣泛溝通與交流，共同推動技術發展與進步。我們整理了幾個最為關注的問題與大家共享：

　　出發點：針對血液樣本進行DIA深度開發的意義在哪？

　　重要性：血液樣本毫無疑問是臨床醫學研究最重要、最高頻分析的樣本類型，尤其在標志物研究方面具有無可替代的地位。

　　傳統技術的瓶頸：血液樣本是蛋白質組分析的難點，因為血液中的白蛋白、IgG等高豐度蛋白占據了90%以上的含量，而質譜會反復掃描這些高豐度蛋白，導致有意義的低豐度蛋白被采集到的過少。因此，為了能夠檢測到更多、更有意義的蛋白質，在傳統的蛋白質組學的分析模式下，目前的常規策略是：先通過親和方法去除高豐度蛋白，再通過大量的預分級進行檢測。該分析模式的問題在于：

　　（1） 關于高豐度蛋白的去除問題：高豐度蛋白本身雖然不是大家研究的對象，但卻是重要的載體，血液中非常多的蛋白、代謝分子都會與高豐度蛋白結合。高豐度蛋白去除的同時，很多與其結合的蛋白也會被去除。因此，高豐度蛋白的去除過程對實驗結果的真實性、準確性有一定的影響。有數據表明，對于某些重要蛋白，去除高豐度會影響這些重要蛋白是否表達差異確定。

　　（2） 關于精準醫療、標志物研究的問題：在精準醫療、大數據分析的研究模式下，臨床樣本的分析方案，已經逐漸摒棄將組內樣本混合的模式，而是傾向于將每個樣本進行獨立的采集和分析。因為，這種模式能盡可能保留信息的完整性、真實性，更有利于數據的有效分析和延展性挖掘。在這種大規模樣本的分析過程中，傳統的蛋白質組分析模式采用的大規模高豐度蛋白去除、大規模預分級實驗過程，不僅意味著巨大的實驗成本，更重要的是其對實驗操作的平行性是個巨大的挑戰（這些預處理過程造成的實驗誤差，是難以通過內標、算法等方式校正回來的）。

　　為什么要用DIA技術？

　　首先，不同于傳統蛋白質組的優先采集高強度信號的DDA數據采集模式，DIA采用的全掃描采集模式，使得其受到高豐度信號的影響大大降低。所以DIA在血液這種高豐度蛋白構成特點的樣本分析上，會更有優勢。越難的樣本，DIA越能發揮出技術特色。上海中科新生命的DIA平臺還對激光顯微切割的組織樣本進行過分析，其數據量也比常規方法提高0.5-1倍。其次，DIA所具備的高重現性、高準確性的特點，可以在大規模樣本分析過程中，盡可能地保證平行性和準確性，無疑是精準醫療、標志物研究等大規模樣本分析項目的首選，這也是為什么美國、瑞士、澳大利亞的精準醫療國家項目均采用DIA平臺的原因之一。

　　血液DIA的分析能力提高這么多，可信度有多高？

　　對于血液DIA的分析能力一下子提高了這么多，相信很多人肯定會產生疑問。所以我們已經對DIA數據設置了嚴格、高標準的“三重數據過濾”：protein FDR、peptide FDR和score值。其次，在分析平臺方面也進行了改進，主要包括以下兩方面：

　　色譜提升：一方面，在蛋白質組的分析流程中，色譜的重要性不亞于質譜，色譜的分離效果，直接影響質譜對信號的采集效率。另一方面，質譜采集到的信號，是否能夠用于定量，也需要滿足一定的色譜峰條件。色譜的穩定性，還直接決定了數據的重現性和準確性。

　　數據庫提升：質譜獲得原始數據只是圖譜與數字符號，數據庫搜索過程決定了原始數據有多少可以變為真正有用的數據。DIA技術由于全掃描的采集方式，其原始數據的復雜性遠遠高于傳統蛋白質組技術，高度依賴于預先構建的圖譜庫對DIA的數據進行搜庫。由于我們是最早開展DIA分析的平臺，在已經積累了大量血液樣本質譜數據的前提下，已經構建成功獨有的血液樣本圖譜庫。項目開展過程中，不但會為每個項目構建其特有的圖譜庫，還會加上本平臺自有的血液圖譜庫，從而實現更高覆蓋度地對DIA數據進行分析。

　　總 結

　　在大規模樣本分析的情況下，除了DIA本身具有的高覆蓋度、高重現性和高準確性上的優勢外，其無需去除高豐度蛋白、無需進行預分級的優勢，最大程度地保證了實驗結果的真實性和平行性。在原有DIA分析體系的基礎上，升級的分析體系進一步實現了更深度的檢測，實現了數據量的進一步提升。