如何提取蛋白質？

　　對于每個大腸桿菌表達的目的蛋白，確定其產生、定位及估計培養基或細胞中的產量都相當重要。為了簡化確定工作，通常對總細胞蛋白及培養液、周質、可溶胞質和不溶胞質部分進行小規模分析。分析的結果有利于誘導條件優化或確定大規模誘導條件，以及采用合適的蛋白抽提方法用來純化目的蛋白。下面簡單的介紹總細胞蛋白的提取與分析。

　　1、生長和誘導

　　1）按如下操作準備 pET 重組子（DE3 溶原菌）的起始培養液：從平板或甘油保存菌中接一環細胞加入3ml 含有適當抗生素的培養液中。

　　2）37℃ 250rpm培養至OD600約為0.5。取3ml 培養液加入100ml 含抗生素的培養基中。

　　3）在適當溫度搖床培養至OD600約為0.5-1.0（如LB培養基2－3 小時，37℃）。生長過程中無菌條件下取出樣品測定OD600值。

　　4）在誘導之前，將100ml 培養液分為2份各50ml。其中一份加入IPTG，另一份不加IPTG 作為不誘導對照。對于帶有T7lac 啟動子的質粒，加入IPTG 至終濃度1mM (500μl 無菌的100mM IPTG)，而對于普通T7 啟動子加入200μl IPTG至終濃度為0.4mM。對于lacY突變菌株（Tuner，Rosetta-gami和Origami B）可改變IPTG濃度。在適當溫度培養適當的時間。注意，當融合蛋白被運輸至周質，延緩誘導（16小時或過夜）可以促進蛋白滲漏入培養基中。

　　2、誘導培養物的光密度分析

　　1）在誘導后收集細胞前，充分搖蕩使上清液均勻，在誘導和未誘導的培養液中各取出0.5-1ml。

　　2）盡量準確的確定 OD600值。可以通過用相同的培養基進行稀釋（通常為1：5 到1：10稀釋）使OD600讀數在0.1和0.8之間。

　　3）在工作表中記錄稀釋倍數和 OD600讀數。

　　3、總細胞蛋白的提取

　　1）在細胞富集之前，取1ml 培養液離心1 分鐘。去除上清液。倒置使沉淀流干，過多的培養基由紙巾吸干。

　　2）與 100μl 的磷酸緩沖鹽（PBS）混和以重懸沉淀。

　　3）加入 100μl 的4×SDS上樣緩沖液與一個小槍頭按如下設置進行超聲波處理：電力水平2－3，功率20－30％（Branson Sonifier 450，超聲條件可按儀器的不同而改變）。另外，將樣品流經27 gaμge needle 幾次以降低其粘稠度。

　　4）迅速在 85℃加熱樣品3 分鐘使蛋白變性，SDS-PAGE分析之前－20℃保存。

　　4、優化 SDS-PAGE電泳上樣體積

　　為了簡化凝膠電泳和 Western分析，可以用兩張工作表來記錄數據和計算對標準小塊膠規格化的上樣體積。公式取決于準確的OD600 的讀數以及濃度系數的獲得。樣品濃度系數等于初始培養液體積除以最終體積。