如何對cDNA、gDNA進行選擇性引物設計？

設計策略

PS：該方法適用于檢測或部分 DNA 片段克隆，不適合全長基因克隆

反轉錄 PCR 的主要問題是基因組 DNA (gDNA) 污染的存在，這將導致產生假陽性信號，特異性降低或對特定 RNA 的過高估計。為了消除 RT-PCR 中 gDNA 的干擾，可將引物設計為與兩個外顯子的接合部退火，該點為 cDNA 序列專有，因此 gDNA 將不能被擴增。

cDNA 特異的引物可通過三個途徑設計（如下圖所示）。

cDNA、gDNA選擇性引物設計原理圖

1. 引物橫跨外顯子-外顯子接合部。設計的引物如果一半與一個外顯子的 3'端結合，而 另一半與相鄰外顯子的 5'端結合，它將只與 mRNA 或由已剪切的 mRNA 合成的 cDNA 退 火，而不與 gDNA 結合，因而可以避免對 gDNA 污染的擴增。正向或反向引物都可設計為 橫跨外顯子接合部；而另一個引物可設計為結合于另一個外顯子接合部或在完全位于外顯子 內部的位點上。

2. 外顯子完全配對-內含子交叉配對引物。為了從 cDNA 和 gDNA 混合物中選擇性地擴增 gDNA, 設計的引物應與外顯子-內含子接合部退火，這種引物叫做外顯子完全配對-內含子交叉配對（exon-primed intron-crossing，EPIC) 引物（Bierneetal. 2000)。EPIC 引物可 在系統發育研究中用于擴增同源的內含子區域，因為外顯子序列相對內含子而言更保守。

3. 引物位于外顯子-外顯子接合部的側面。設計的 RT-PCR 引物位于至少含一個內含子 的區域的側面。這樣以 cDNA 為模板擴增的片段要小于以 gDNA 為模板擴增的片段，這種 大小的差異可以幫助檢測 gDNA 污染的存在。