| 實驗步驟 |
第 1 階段：影印鋪板與工作庫的制備
一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
羧芐西林（100ug/ml 儲存溶液）
乙醇（100%)
甘油，45%(體積分數）
LB 液體培養基。（1L LB 液體培養基含有 10 g 胰蛋白胨、5 g 酵母提取物、5 gNaCl)
超級液體培養基。(1L 超級液體培養基含有 32 g 胰蛋白胨、20 g 酵母提取物、5 gNaCl、5 ml 1mol/LNaOH）
2. 生物分子
核對過序列的母系克隆或 EST(例如，gf211release，ResearchGenetics)
3. 其他儀器
具有水平（吊桶式）轉頭的離心機，深度 6.2 cm, 可以離心微量滴定板和過濾板（例如，Sorvall SuperT 21，Sorvall)
Airpore Tape Sheets(Qiagen)
Bunsen 噴燈
培養箱，預設為 37°C
96 針接種器（V&P Scientific)
深 96 孔微量滴定板，1.0 ml,PP(V WR International)
U 形底的 96 孔微量滴定板（Corning)
紙巾
帶有深孔板固定裝置的振蕩培養箱，37°C
帶拉鏈的袋子（zip-lock bag)，1 加侖（約 4L)
二、方法
1.將密封的母系克隆板在 37°C 下培養過夜。
2.準備制備克隆系的工作復本：標記 96 孔圓底（U 形底）的微量滴定板，在每一個孔中分裝 100ulLB 液體培養基，含有100ug/ml 羧芐西林。
用這些工作復本來保持母系克隆。檢驗確保這些克隆都具有載體賦予的氨芐西林抗性。
3.在水平式微量滴定板轉頭中離心母系克隆板，1000r/min 離心 2 min，除去板子封條上的冷凝水。
4.在一個小燒杯中裝一些 100% 乙醇，將 96 針復制工具在乙醇中浸泡。然后從乙醇中取出工具，并燒接種針。
5.短暫冷卻后，將復制工具在母系克隆板中蘸一下，然后轉到工作克隆板上。如果必要，每個板子都重復接種一次。
6.將接種后的 LB 板子蓋上蓋子，放到裝有濕紙巾的 1 加侖（3.78541dm3) 帶拉鏈的袋子中，將袋子密封后，在 37C 培養過夜。
7.在深孔板的每個孔中，分裝 1ml 含有 100ug/ml 羧芐西林的超級液體培養基。
這些板子將作為制備模板的培養液的來源。
8.1 天后，用復制工具直接從新鮮的 LB 板中接種至深孔板。
9.用 Qiagen Airpore Tape Sheets 將深孔板密封，并在上面蓋上塑料蓋，在 37°C 振蕩培養箱中以 200r/min 培養 24 h。
10.對于要被冷凍（-80°C) 作為以后培養源的板子，在每個孔中加入 5ul 45%(體積分數）的無菌甘油。從剩下的板子中分離質粒模板。
第 2 階段：質粒模板的分離
一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
乙醇，70%
T low E 緩沖液（10 mmol/LTris-HCl，O.lmmol/LEDTA,pH8.0)
2. 離心機和轉頭
具有水平（吊桶式）轉頭的離心機，深 6.2 cm, 可以離心微量滴定板和過濾板（例如，Sorvall SuperT 21,Sorvall)
3. 專用設備
封板器
渦旋混勻器
4. 載體和細菌菌株
從上面第 1 階段第 9 步獲得的細菌培養液
&附加試劑
AlkalineLysisMiniprepkit,96 孔 (EdgeBiosystems)
二、方法
1. 將裂解緩沖液（Edge Biosystems Kit) 加熱到 37°C, 使 SDS 溶解。
2. 加入 lml 的 RNA 酶溶液至 100 ml 重懸浮緩沖液（Edge Biosystems Kit) 中。在 4°C可保存 3 個月。
3. 在 EdgeBiosystemsKit 接收板的每個孔中，加入 350ul 細菌培養液。將過濾板放在其頂部，并用帶子固定。
4. 用裝有 96 孔板轉頭的離心機，將深孔板中的細菌培養液以 1500 g 離心 7 min。
5. 迅速地在干凈的紙巾上將板子顛倒，并輕扣出剩余的培養基。
這一步不要耽擱，否則沉淀會松動，在倒出培養基時可能損失。
6. 每個沉淀各加 100ul 懸浮緩沖液重新懸浮，渦旋混勻，直到所有的沉淀都懸浮起來。
懸浮不充分會造成細胞呈塊狀，在隨后的步驟中不會裂解。
7. 在每個孔中加 100ul 裂解緩沖液，輕輕搖動板子混合 lmin, 避免使細菌染色體 DNA斷裂。
8. 在每個孔中加 100ul 沉淀緩沖液，混合 1 min。
9. 在每個孔中加 100ul 中和緩沖液，并渦旋混勻 20s。
10. 將深孔板中的混合物轉到預先裝配好的過濾/接收組裝板中。
11. 在裝有 96 孔板轉頭的離心機中，將疊起來的板子以 1500 g 離心 12 min。
12. 取下并棄去過濾板，從接收板中倒出乙醇和濾出液，在干凈的紙巾上吸干剩余的乙醇。
13. 在每個孔中加入 500ul 70% 乙醇，立即倒出，并在干凈的紙巾上吸干剩余的乙醇。
14. 除去蓋子，將板子放在干凈的抽屜中，并用干凈的紙巾覆蓋，干燥過夜。
15. 各加 200ul T low E 緩沖液，懸浮每個 DNA 沉淀，用封板機將板子頂部密封，使沉淀在 4°C 再水化至少 2 天。若長期保存，應放在-20°C。
第 3 階段：克隆的擴增與 PCR 產物的評估
一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
DEPC 處理過的 H20
TAE 緩沖液，1×（40 mmol/L Tris-乙酸鹽，1 mmol/L EDTA，pH 約 8.5)
DNA 點樣緩沖液（200 g/LFicoll400，0.1mol/LNa2EDTA，pH8.0,10 g/LSDS，2.5 g/L 溴酚藍，2.5 g/L 二甲苯腈)
dATP 溶液，100mmol/L(Pharmacia)
dGTP 溶液，100mmol/L(Pharmacia)
dTTP 溶液，100mmol/L(Pharmacia)
dCTP 溶液，100mmol/L(Pharmacia)
2. 酶和酶緩沖液
AmpliTaq DNA 聚合酶（Perkin-Elmer)
GeneAmp PCR 緩沖液，10X(Applied Biosystems)
3. 核酸和寡核苷酸
載體或基因特異性引物（1mmol/L)
100bp DNA ladder(New England Biolabs)
4. 凝膠
球脂糖凝膠（20 g/L,TAE 緩沖液)
5. 專用設備
薄壁 PCR 板和 Cycleseal PCR 板封板器（Robbins Scientific)
可容納 4 個 50 孔梳子的電泳裝置
熱循環儀
6. 附加器材
瓊脂糖凝膠電泳所需的設備和試劑，包括溴化乙錠
1. 為每個要擴增的 96 孔板配制含有以下成分的主體 PCR 混合液。
PCR 緩沖液，10X(含有 15 mmol/LMgCl2)1000ul
dATP(100mmol/L)20ul
dGTP(100mmol/L)20ul
dCTP(100mmol/L)20ul
dTTP(100mmol/L)20ul
引物 1(lmmol/L)5ul
引物 2(lmmol/L)5ul
AmpliTaq 聚合酶（5U/ul)100ul
DEPC 處理過的 H20 8800ul
2. 標記好 96 孔 PCR 板，在每個孔中分裝 100ulPCR 混合液。
輕扣 PCR 板，確保沒有氣泡殘留在孔的底部。
3. 在每個孔中加入 1ul 純化過的質粒模板，并蓋好蓋子。
4. 進行下面的循環反應。
在進行質量對照的凝膠分析時，將板子保存在 41°C。
5. 通過瓊脂糖凝膠電泳，檢測 PCR 產物。
凝膠成像只能對產物進行粗略的定量，但可以提供很好的產物組成的特征。
6. 從每個孔中取 2ul, 與 2ul 點樣緩沖液混合。
7. 以 100bp DNA ladder 作為標準，在 2% 瓊脂糖凝膠上分析樣品。
每個泳道應該顯示一條單一的主帶，各泳道之間產物的亮度應該相同。
第 4 階段：PCR 產物的純化與定置
一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
乙醇/乙酸鹽混合液 (95% 乙醇，5%3mol/L 乙酸鈉，PH6.0)
乙醇，70%
SSC 緩沖液，20X(3mol/LNaCl，0.1mol/L 檸檬酸鈉·2 H20，用 1mol/LHCl，調 pH 至 7.0)
TAE 緩沖液，1X(40 mmol/LTris-乙酸鹽，1mmol/LEDTA，pH 約 8.5)
DNA 點樣緩沖液（20%Ficoll400,0.1mol/LNa2EDTA,pH8.0，10 g/LSDS，2.5 g/L 溴酚藍，2.5 g/L 二甲苯腈)
2. 離心機和轉頭
具有水平（吊桶式）轉頭的離心機，深 6.2 cm, 可以離心微量滴定板和過濾板（例如，SorvallSuperT21，Sorvall)
3. 核酸和寡核苷酸
100bpDNAladder(New England Biolabs)
雙鏈 DNA 標準樣，變化范圍是 0、50ug/ml、100ug/ml、250ug/ml、500ug/ml
參考雙鏈 DNA(0.5ug/ml)(Invitrogen)
4. 凝膠
瓊脂糖凝膠（20 g/L,TAE 緩沖液）
5. 專用設備
V 形底的 96 孔微量滴定板（Corning)
Immunowash 微量滴定板清洗儀（BioRad)
紙巾
可熱封的儲存袋和熱封器
65°C 培養箱
可容納 4 個 50 孔梳子的電泳裝置
電泳電源
用于熒光檢測的 96 孔板（Dynex)
熒光計（例如，Perkin-Elmer Analytical Instruments)
6. 附加器材
FluoReporter Blue dsDNA Quantitation Kit(Molecular Probes)
二、方法
1. 在 V 形底 96 孔板的每個孔中，加入 200ul 乙醇/乙酸鹽混合液。
2. 將每個孔中的 100ulPCR 產物，轉到 V 形底的板子中，并用 75ul 移液管吹吸 4 次混勻。
3. 將板子放在-80°C 冰箱 1h, 或者在-20°C 保存過夜。
4. 將板子解凍以降低其脆性，并溶解孔中可能形成的冰。
5. 將板子放入帶有微量滴定板轉頭的離心機中，以 2600 g、4°C 離心 40 min。
6. 用 Immunowash 微量滴定板清洗儀吸去每個孔中的上清液。
建議在每個孔的底部留約 10~20ul, 以避免將沉淀攪起。
7. 用 Immunowash 微量滴定板清洗儀在每個孔中加入 200ul70% 乙醇。
8. 以 2600 g 4°C 離心 40 min。
9. 用 Immunowash 微量滴定板清洗儀將每個孔中的上清液吸去。
10. 用紙巾將板覆蓋，在一個封閉抽屜中干燥過夜。
1.PCR 產物的重懸浮
11. 在每個孔中，加入 40ul3XSSC。用薄片密封器或合適的封條將板子封好，注意要將每個孔都封嚴。
重新懸浮 PCR 產物的緩沖液，是由制作微陣列的點樣儀和芯片決定的。
12. 將板子放在熱封的袋子中，里面放有 3 X SSC 浸濕的紙巾。
13. 將袋子在 65°C 培養箱中放置 2 h, 關掉培養箱使板子逐漸冷卻。
在培養箱中冷卻板子，可以避免封條上產生冷凝水。
14. 取 1ul 重新懸浮的 PCR 產物，在 2% 瓊脂糖凝膠上分析，如第 3 階段中所述。
充分的沉淀和重懸浮，將產生非常亮的條帶。
15. 裝有重懸浮 PCR 產物的板子，在- 20°C 保存備用。
2. 用熒光測定法對 PCR 產物定量
16. 在熒光測定專用 96 孔板的每個孔中，加入 200ul 熒光劑緩沖液（FluoReporter Blue dsDNA Quantitation Kit)。
17. 在熒光測定板的每個孔中，加入 1ulPCR 產物。
18. 在熒光測定板的最后一排，各加 1ul 雙鏈 DNA 標準樣，分別為 0、50ug/ml、100ug/ml、250ug/ml、500ug/ml dsDNA。
19. 設定熒光計激發光為 346nm, 發射光為 460nm。
20. 在 0~500ug/ml dsDNA 的范圍內，測試標準樣是否懸線性的，以及是否可重復。
21. 從所有對照和其他樣品測得的數值中，減去 0ug/ml 樣品的數值后，按照下面的方程
計算 PCR 產物中 dsDNA 的濃度。
22. 根據上面的計算，對于超出預計印刷濃度范圍（0.1~0.5ug/ul) 的 PCR 產物，要調整濃度。
第 5 階段：印制微陣列
完成了前面的方案，研究者將會得到制作微陣列所必需的點樣材料。印制微陣列的方案參數是由所使用的點樣儀和芯片決定的。由于有幾種點樣儀和芯片的組合可以用來制作微陣列，這里不再給出
PCR 產物點樣的詳細方案，可以在其他地方找到（Bowtell and Sambrook 2003)。
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