多色纖維熒光原位雜交實驗

培養細胞懸液PBS暈圈溶液牛血清白蛋白乙醇醚10 X 切口緩沖液核苷酸混合物Bio-16-dUTP二硫蘇糖醇酵母 RNA鮭魚精 DNASSCTNT 溶液TNB 溶液

微型離心機Camag UV 盒 II熒光顯微鏡探針DNA

一、制備含 DNA 纖維的載玻片標本

大多數類型的細胞，只要保持沒有固定或干燥且細胞核完整，都適于做纖維 FISH 分析。凍存組織標本和沉淀的細胞團塊，只要組織能重新懸起成細胞懸液，就還可以使用。有大量細胞質的細胞需要更劇烈的處理以使其裂解。一般情況下都是先采用最溫和的方法，如果裂解不充分，就增加 SDS 的處理。

制備開始前，將下列物品放置在冰上：

1.每種暈圈溶液和超純水配制的 0.05%SDS 溶液分別放入 IOOmL 燒杯中，另外兩個 IOOmL 燒杯分別裝超純水。

2.一個試管裝 20%BSA，另一個試管裝 PBS。

3.玻璃板（5 mm 厚）。

制備細胞懸液

適用于培養的細胞，外周血細胞或者其他細胞懸液：

1.將 ImL 細胞懸液或胰酶消化的細胞（10000?100000 個細胞）裝在 Eppendor 僧中，用微量離心機離心數秒鐘。

2.棄上清。

3.將細胞重懸于 20(^LPBS 中（4°C)。

適用于冰凍組織：

1.切一片或幾片 45；xm 厚度的冰凍組織片（見注釋 3)。

2.裝在 Eppendorf 管中，置于干冰上。

3.使用前一直放置在干冰上。

4.融化組織 30s 左右。

5.加入大約 50(VLPBS(4°C)。

6.劇烈上下抽吸碎組織片至形成懸液。

制備 DNA 纖維載玻片

1.取 20pL 細胞于離心管中，加 PBS(4°C) 至 47.5pL，加入 2.5^20%BSA/PBS 溶液，混合均勻。

2.取上述懸液滴到標本上，用吸頭將液體均勻的鋪在整張載玻片上。

3.將載玻片放置在冰冷的玻璃板上 2 min。

4.將載玻片（磨砂邊朝上）垂直立在紙上瀝去多余的液體。

5.用壓縮空氣緩慢風干直到片子邊緣干燥（外周血細胞和培養細胞等容易裂解的細胞，可省略步驟 6?9)(見注釋 4)。

6.輕輕地將片子垂直浸泡在暈圈溶液 1 中 30s。

7.大約用 3s 時間從溶液中緩慢取出片子，然后用 7s 的時間用紙吸干多余的液體（見步驟 4)。

8.輕輕地將片子垂直浸泡在暈圈溶液 2 中 30s。

9.大約用 3s 時間緩慢取出片子，然后用 7s 的時間用紙吸干多余的液體（見步驟 4)。

10.輕輕地將片子垂直浸泡在暈圈溶液 3 中 45s。

11.大約用 3s 時間緩慢取出片子，然后用 7s 的時間用紙吸干多余的液體 (見步驟 4)。

12.用紙擦凈片子背面。

13.將片子水平放置在在冰冷的玻璃板上。

14.將濕片子放置在 UV 燈下，保持 1?IOcm 的距離（見注釋 5)。

15.立即用 254nm 波長照射 1?IOmin(見注釋 6)。

16.將片子垂直放置在紙上 IOs(見步驟 4)。

17.輕輕地將片子垂直浸泡在暈圈溶液 4 中 30s。

18.大約用 3s 時間緩慢取出片子，然后用 7s 的時間用紙吸干多余的液體 (見步驟 4)。

19.輕輕地將片子垂直浸泡在暈圈溶液 5 中 30s。

20.用大約 3s 時間緩慢取出片子，然后用 7s 的時間用紙吸干多余的液體 (見步驟 4)。

21.用超純水洗 2 次。

22.垂直將片子立在架子上使其干燥，室溫放置數分鐘。

23.用熒光顯微鏡 16 倍物鏡和 TRITC 濾光片（見注釋 6) 觀察片子以及檢查是否（a) 細胞適度裂解（圖 1C)(見注釋 7);(b) 細胞的數目足夠（圖 1D)(見注釋 8);(c) 彗星狀結構的（即纖維）數目足夠（圖 1E)(見注釋 8)。

24.雜交前放置在室溫過夜干燥；要放在密閉的容器中一 20°C 可長期保存。

二、探針標記

1.在離心管中配制以下混合物：5juL10X 切口緩沖液、5^L0.1m 〇 l/LDTT、知 L 核酸混合物、0.5^L 已標記的核苷酸、ljugDNA，用超純水調整體積至 44，。

2.將混合物放置在冰上，加 I1ULDNA 聚合酶。

3.用冰冷的超純水按 1:500/1:1000/1:2000 梯度稀釋 DNaseI 儲存液。

4.加入 5pL 稀釋的 DNaseI。

5.16°C 孵育 2 h。

6.將反應體系放在冰上，取 5pL 用 2% 瓊脂糖凝膠檢測片段大小（見注釋 9)。

7.加入 20.jugssDNA 和 20jLig 酵母 RNA。

8.加入 0?1 倍體積的 3mol/LNaAc 和 2.5 倍體積的一 20°C 無水乙醇沉淀 DNA。

9.冰水混合物上放置 30 min。

10.用微量離心機以最大轉速離心 30 min，去掉乙醇并空氣干燥沉淀物。

11.用雜交混合液重懸探針，濃度為 30?60ng/jaL，37°C 溶解 30 min，避光儲存（4°C 或一 20°C)。

三、雜交

1.將含有纖維的載玻片在 80°C 玻片電熱板上烤 2 h(見注釋 10)。

2.制備探針混合物：每種標記的黏粒/PAC/P1 探針 3ng/VL 和每種探針加 50 倍過量的 Cot-1DNA 并加雜交混合液至 KVL。

3.探針混合物在 80°C 變性 8 min。

4.冰上放置 2 min 退火。

5.混勻，以微量離心機稍離心。

6.37°C 水浴預復性探針 30 min。

7.將 12(^L 變性混合液（70% 去離子甲酰胺/2XSSC/50 mmol/L 硫酸葡聚糖）加到 24 mmX60 mm 蓋片上。

8.將載玻片有纖維一面覆蓋到蓋片上，使變性混合液自然展開。

9.翻轉載玻片，使蓋片一面朝上，將載玻片放在 80°C 電熱板上精確地加熱 3 min。

10.輕輕彳頃斜載玻片，使蓋片自然滑脫。

11.冰上用 2XSSC(4°C) 洗 2 min。

12.用 70% 乙醇（一 20°C) 洗 5 min。

13.室溫下依次用 90%、100% 乙醇脫水。

14.將標本垂直放置在架子上，氣干。

15.將 IO^L 探針混合物加到載玻片上。

16.蓋上 24 mmX24 mm 蓋片。

17.正面朝下于 37°C 濕盒中雜交過夜。

四、雜交后洗脫和免疫檢測

于 37°C 水浴中預熱 400 mL2XSSC:

1.在盛有 37°C2XSSC 染色缸中浸泡 5 min，使蓋片自然滑落（見注釋 11)。

2.37°C 下 2XSSC 中洗 3 次，每次 5 min。

3.TNT 溶液中洗 5 min。

4.將 120^LTNB 溶液加到 24 mmX60 mm 蓋片上，將片子有纖維的一面覆蓋到蓋片上。

5.正面朝下于 37°C 濕盒中孵育 20 min。

6.制備 I:1000 鼠抗地高辛抗體和以 TNB 溶液稀釋的 I:100 德克薩斯紅標記的鏈霉親和素，每張載玻片 12 〇 iuL。

7.在 TNT 溶液中洗脫蓋片。

8.將抗體混合物加到 24 mmX60 mm 蓋片上，反轉載玻片覆蓋到蓋片上。

9.正面朝下于 37°C 濕盒中孵育 20 min。

10.在 TNT 溶液中洗脫蓋片。

11.TNT 溶液洗 3 次，每次 5 min。

12.以 TNB 溶液配制 1:1000FITC 標記的兔抗鼠抗體和 1:100 生物素化山羊抗鏈霉親和素抗體，每張載玻片 12 〇^L。

13.將抗體混合物加到 24 mmX60 mm 蓋片上，反轉載玻片覆蓋到蓋片上。

14.正面朝下于 37°C 濕盒中孵育 30 min。

15.以 TNB 溶液配制 1:100FITC 標記的山羊抗兔抗體和 1:200 德克薩斯紅標記的鏈霉親和素，每張載玻片 120/iL。

16.在 TNT 溶液中洗脫蓋片。

17.TNT 溶液中洗 3 次，每次 5 min。

18.將抗體混合物加到 24 mmX60 mm 蓋片上，反轉載玻片覆蓋到蓋片上。

19.正面朝下于 37°C 濕盒中孵育 30 min。

20.在 TNT 溶液中洗脫蓋片。

21.TNT 溶液中洗 3 次，每次 5 min。

22.依次用 70%、90%、100% 乙醇系列脫水。

23.空氣干燥。

24.加 IO1^L 抗淬滅劑到載玻片上，蓋上 24 mmX60 mm 蓋片。

五、信號觀察與結果判讀

載玻片上的背景非常高是由于探針的片段太長，然而，這種背景是很容易與線性排列的串珠狀纖維區分開（圖 1E)。根據 Vaandrager 等的方法對 FISH 信號進行分析 [11]。已知的探針間距離和（或）探針長度（如通過限制酶酶切作圖或脈沖場凝膠電泳所獲得的）提供了內部的長度參照 [14]。不同載玻片上 DNA 凝集程度的不同可以使用數字化圖像的計算機輔助延伸和壓縮加以消除，以達到正常條形碼的全長。當出現諸如斷裂導致的異常條形碼時，來自于正常等位基因的正常條形碼信號的存在可證實其雜交效率。定位斷裂點所必需的全部纖維的數量依賴于最初細胞懸液中腫瘤細胞的數量。然而，通常通過測量 5 個正常與異常的條形碼殘基就可以準確定位斷裂點 [14]

注釋

1.盡管許多載玻片的表面處理都適合進行纖維 FISH，但就我們的經驗來看，特殊的涂層處理是不必要的。

2.建議采用柱子純化探針 DNA 用于缺口平移，因為 DNaseI 對很少量的苯酚、鹽和 RNA 的污染非常敏感。

3.可以將標本切成幾片并于一 70°C 保存至兩個月。每次實驗需要的切片數量依賴于裂解細胞所使用的條件，劇烈的裂解可從載玻片上脫落更多的細胞。

4.使載玻片保持水平會有彩虹樣水印產生。

5.UV 照射使 DNA 產生缺口。照射過量會產生小的 DNA 片段，這些片段會從片子上脫落；而照射劑量太小，將導致僅有很少信號的無效雜交。因此，每次在實驗前經常確定適當的照射劑量事實非常重要的，采用從 1?IOmin 變換照射時間長度以及從 1?IOcm 變換 UV 燈與載玻片之間的距離。也可以使用 Strata-Iinker 裝置。切記在 UV 照射的全程需要對眼睛和皮膚采取適當的保護措施。

6.不要蓋蓋玻片，也不要使用油。

7.應該出現彗星狀的結構（圖 1E)。若細胞核仍呈亮紅色球狀，則表明裂解不充分（圖 1C)。這種情況下需進行以下步驟：將載玻片慢慢垂直浸泡在 0.05%SDS 中 10?30s，瀝盡過量液體，將載玻片在暈圈溶液 1 中浸泡 IOs 后繼續步驟 10。但是 SDS 常常造成固定在載玻片上的細胞脫少，這種情況下，也應該用更多的細胞或者使載玻片更干燥。載玻片越干燥，裂解就越困難，所以應注意標本不要太過干燥。

8.當整張載玻片都出現彗星狀的結構以及排列整齊時，表明纖維數量是足夠的（圖 1E)。如果載玻片呈云霧狀，而且可見亮的晶體狀物質，就表示細胞數量太高了，應該減少細胞的數量（圖 1D)。如果整張載玻片完全是黑的（除了雜質），那么就應該在步驟 3 后檢查細胞懸液，確認有細胞存在。如果在懸液中很容易觀察到細胞，那就有可能裂解步驟時細胞脫落了，則應跳過步驟 5, 直接在步驟 6 中吹干載玻片，如可以完全吹干上半部，保留潮濕的下半部，然后用暈圈溶液 3 處理。如果采用上述步驟后細胞還是裂解不充分，那只有重新離心細胞懸液，棄上清后用 50?IOOjULFCS 重懸細胞并于一 70°C 凍存過夜，然后快速融化并從步驟 3.I.1 開始重做實驗。

9.探針用生物素和（或）者地高辛標記，理想的探針片段大小為 400~800bp。探針片段的大小可以采用標準的缺口平移程序通過調整 DNaseI 的用量加以控制。可用 2% 瓊脂糖凝膠電泳檢查片段大小，并以生殖細胞纖維進行檢測。標記后，沉淀探針并溶于雜交混合液中，可以同時混合多個探針而不改變雜交條件。

10.室溫下干燥過夜或者經一 20°C 保存的載玻片都可以使用。

11.任何時候都不要使用外力剝離蓋玻片，應該在染色缸中浸泡自然脫離。