多肽融合標簽的移除策略

謝浩 楊程 陳麗娥
(武漢理工大學生物科學與技術系，武漢430070)
摘要：多肽融合標簽能夠賦予目標蛋白新的特性，便于目標蛋白的定位、追蹤、純化以及結構和相互作用研究．但在很多情況下，尤其是研究蛋白質結構或分離純化藥用蛋白時，需要將多肽融合標簽從融合蛋白上切除，以降低和消除多肽融合標簽對目標蛋白結構和功能的影響．可用來切除多肽融合標簽的方法主要有4 種，即化學法、內切蛋白酶法、外切蛋白酶法以及自我剪切法．介紹和比較了每種方法的基本原理、應用以及研究進展．
關鍵詞融合蛋白，多肽融合標簽，標簽移除，內含肽，蛋白酶
融合標簽技術是利用DNA 重組技術將不同來源的基因或基因片段進行拼接，在基因水平上改造目標蛋白，產生含有融合標簽的重組蛋白，不僅保持原有蛋白質的功能活性，還具有融合標簽所特有的生理生化特性．隨著蛋白質組學的發展及藥用蛋白的研究開發，融合標簽技術被廣泛地應用于科研及工業領域，尤其在蛋白質分離純化、膜蛋白結構研究、蛋白質生理功能研究等方面有著重要作用[1～3]．
雖然一些多肽融合標簽能夠促進目標蛋白的正確折疊和溶解，利于蛋白質的表達和定位，但是也可能對目標蛋白造成不利影響，主要表現在以下兩個方面．

首先，融合標簽可能會影響目標蛋白的構象．例如基因調控蛋白AreA 連接多聚組氨酸標簽后，與野生型蛋白相比，雖然蛋白質的功能沒有顯著改變，但是蛋白質構象卻發生了細微變化[4]．因此，在研究蛋白質結構時，需要移除融合標簽，排除和減少融合標簽對蛋白質結構的影響．
其次，融合標簽可能會抑制和影響目標蛋白的活性．例如重組氨基肽酶B 的C 端連上多聚組氨酸標簽后，其外切蛋白酶活性降低了近一半[5]．而對用于癌癥治療的單抗CC49單鏈Fv 片段(scFv)的研究表明，當多聚組氨酸標簽連接于scFv 的C 端時，有可能部分覆蓋scFv 抗原結合位點，從而極大地降低了scFv對抗原的結合能力[6]．因此，在研究蛋白質或酶的性質或功能時，需要充分考慮多肽融合標簽的影響．對于藥用蛋白質而言，融合標簽不僅可能影響目標蛋白的藥效，還會對人體存在潛在威脅，因而多肽標簽的移除變得更為必要．
目前主要通過4種方法移除多肽標簽，即化學法、內切蛋白酶法、外切蛋白酶法以及基于內含肽的自我剪切法．

1 化學方法
化學方法移除多肽標簽需要利用溴化氰 ( cyanogen bromide，CNBr )或羥胺( hydroxylamine ) 處理，所采取的基本策略如下：在目標蛋白與融合標簽之間插入一個甲氨酸殘基，誘導表達并純化后，用溴化氰或羥胺處理所純化的融合蛋白，使融合蛋白在插入的甲氨酸殘基處斷裂，從而使標簽從目標蛋白脫離[7]．例如Fairlie 等[8]發展的用于生產和純化含二硫鍵肽的系統就使用了溴化氰法．他們將純化所得到的融合蛋白用溴化氰處理后，利用RP-HPLC 柱除去脫離的融合標簽，結果得到純度大于95%的目標多肽．相比于酶切法，化學法具有效率高、耗時短、成本低等優點．在上述例子中，融合蛋白用溴化氰處理4 h后切割率接近 100%．相比而言，很多酶需要長達十余小時才能達到理想的切割率．
化學法也有很多不足，例如化學法所需的反應條件容易破壞目標蛋白的結構和功能，而且所使用的溴化氰等試劑具有毒性，不適合藥用蛋白的處理及研究．化學法使用的溴化氰能夠使蛋白質在甲氨酸殘基處斷裂，如果目標蛋白含有內源甲氨酸殘基，會發生非特異性斷裂，導致降解和破壞目標蛋白．而且化學法切割時容易產生副反應，會對修飾一些氨基酸側鏈而改變目標蛋白的特性[7, 8]．這些缺點限制了化學法在移除多肽融合標簽時更為廣泛的應用．

2 內切蛋白酶法
內切蛋白酶能夠識別蛋白質的特殊序列，并從這段序列內部或附近的特定氨基酸殘基處切割蛋白質．使用內切蛋白酶切除標簽的一般策略如下： a．選擇合適的內切蛋白酶，注意避免內切蛋白酶在目標蛋白內部有多余識別位點；b．構建表達載體，在融合標簽與目標蛋白之間引入內切蛋白酶識別序列；c．將所構建的質粒導入宿主并誘導表達，分離純化重組融合蛋白；d．將初次純化的融合蛋白用對應的內切蛋白酶處理；e．再次純化以除去內切蛋白酶及融合標簽．在使用內切蛋白酶法移除融合標簽過程中，需要經過兩步純化，即從細胞裂解液中純化融合蛋白，以及將內切蛋白酶及脫離的融合標簽從目標蛋白中除去．表1 列出了幾種常用的內切蛋白酶。