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  • 發布時間:2022-10-06 09:24 原文鏈接: 外顯子的操作步驟介紹

      ⑴基因組DNA經“霰彈法”切成小片段后,克隆在位于“外顯子捕捉序列”下游的克隆位點上。

      ⑵將這些重組載體匯總后感染反轉錄病毒的專宿包裝細胞系(ecotropicretroviralpackagingcellline)——ψ2細胞系。ψ2細胞提供蛋白質產物使載體(自身不能合成病毒蛋白質)成為反轉錄病毒在細胞里增殖。當反轉錄病毒在細胞內轉錄時,如果插入片段中包含有功能的SA位點,則有可能發生RNA剪接反應而將ⅣS切除。

      ⑶已剪接和未剪接的病毒RNA都包裝在病毒子(virion)中,從細胞培養液中收集后用來感染兼宿反轉錄病毒包裝細胞系(amphotropicretroviralpackagingcellline)PA-317。這使反轉錄病毒再進行一輪復制,并產生能感染猴腎細胞系COS細胞的高效價病毒原種。這樣做是由于上一輪克隆在病毒中的插入片段的剪接效率極低,而在第二輪復制時則大大提高了RNA剪接的機會。

      ⑷從第二個細胞系PA-317細胞中分離得到的病毒,用來感染組成型產生SV40T(腫瘤)抗原的COS細胞。病毒RNA基因組被反轉錄,并在載體上的SV40復制起點作用下,以環狀DNA附加體形式進行復制。

      ⑸從COS細胞中回收復制的附加體DNA,經限制性內切酶DpnI酶切后轉化細菌。在含卡那霉素(Kn)和5—氯—4—溴—3—吲哚—β—D—半乳糖苷(X-gal)的培養基上挑選轉化子。盧—半乳糖苷酶可水解X—gal而生成藍色產物。因此,不產生β—半乳糖苷酶的轉化子菌落則呈白色。

      ⑹只挑選出白色菌落作進一步研究的材料。白色菌落的生成可以有二種原因。一是由于基因發生突變,使夕—半乳糖苷酶失去活性;二是由于在反轉錄病毒生活周期的RNA時期中發生了剪接反應,從而丟失了α,β—半乳糖苷酶基因。

      ⑺如果是基因突變,則大多數將是缺失了載體中的“外顯子捕捉”部分,就可用人的口—珠蛋白基因片段為探針作菌落雜交,很快可得到驗證。

      ⑻如果是真正發生了RNA剪接事件,準確的剪接反應可切除作為標記的ⅣS,使人口—珠蛋白基因的第1外顯子與落入了捕捉陷阱的插入片段中的外顯子序列連接,這可直接測定其序列加以證明。從捕捉到的外顯子出發,就可進一步用作探針去從基因組基因文庫或cDNA文庫中分離出基因。

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