凝膠
瓊脂糖凝膠（1.5%m/V), 用 TBE 配制
核酸與寡核苷酸
寡核苷酸引物 [20 mmol/L,TE(pH8.0) 配制]
分別提取自轉染有對照載體和重組載體的 COS-7 細胞的 RNA(階段 3)。
培養基
含 50ug/ml 氨芐青霉素的 LB 瓊脂平板
專用設備
自動微量加樣器所用的加樣器尖頭
微量離心管（PCR 擴增用 0.5 ml 薄壁離心管，無 RNase）
帶退尖頭裝置的自動加樣器
可設置方案中反應程序的熱循環儀
如熱循環儀無熱蓋. 使用礦物油或封口石蠟防止 PCR 反應混合物的蒸發。封□石蠟不僅可防止蒸發，還可起到在反應混合物加熱之前使反應組分（如引物與模板）暫時隔銫的效果。這可防止在反應的起始階段由于引物非特異的結合模板引發的擴增。
預設溫至 42°C、55°C 和 65°C 的水浴
附加試劑
本方案步驟 14 需要的試劑列在第 1 章，方案 25。
載體與菌株
大腸桿菌 DH5α(或其他可產生α互補的菌株）
載體 pBluescriptⅡ(KS 或 SK)(Stratagene 公司）
方法
cDNA 的合成
1. 以 SA2 寡核苷酸作為引物，用步驟 3 中獲得的胞漿 RNA 作模板制備 cDNA 第一鏈。
在 1 個無 RNase 的 0.5 ml 離心管中混合以下試劑:
RNA 3ul
10x 壙增緩沖液 2.5ul
dNTP 溶液 (每種 1.25 mmol/L) 4ul
0.1mol/LDTT 1ul
3'引物（SA2,20umol/L) 1.25ul
DEPC 處理水 11.25ul
將反應混合物 65°C 放置 5 min。
重要：為降低 RNA 中二級結構的形成，不要將反應混合物放置于冰上。
然后加入：
RNase 抑制劑 1ul
Mo-MLV 反轉錄酶（200 單位） 1ul
42°C 溫育 90 min。
2. 同時使用寡核苷酸引物 SA2 和 SD6 進行 cDNA 第二鏈的有限合成。在一個無菌的薄壁離心管中混合以下試劑：
反轉錄反應混合物（來自步驟 1) 12.5ul
1x 擴增緩沖液 4ul
dNTP 溶液（每種 1.25 mmol/L) 6ul
引物 SA2(20umol/L) 2ul
引物 SD6(20umol/L) 2.5ul
Taq DNA 聚合酶 1~2 單位
加 DEPC 處理水至 40ul
同樣處理只含載體的對照，作為一個重要的 PCR 分析對照。
3. 如熱循環儀無熱蓋，反應混合物上方加入 1 滴（約 50ul) 的輕比重礦物油。或者按熱啟動 PCR 方式加入封口石蠟。將反應管放入熱循環儀。
4. 按下表列出的變性、復性和延伸時間和溫度進行擴增反應。
用于克隆的 cDNA 與載體的制備
5.PCR 反應產物中加入 30 單位的 BstXI, 并加入 1 滴低比重礦物油（如果在前面步驟中未加的話)。將混合后的反應管置 55°C 溫浴過夜。
BstXI 酶切將大大減少空載體剪接產物以及由于載體內含子含隱蔽剪接位點而產生的假陽性。載體質粒 pSPL3 含有多個隱蔽剪接位點。由這些位點引發的異常剪接產物一般只占擴增產物中很小一部分，而且通常也只出現在空載體反應管、pSPL3 上構建的文庫質量很差或者基因組 DNA 中不含通過這種方法可鑒定出的轉錄物。
6. 反應管中再加入 20 單位的 BstXI 并置 55BstXI 溫浴 2~3 h。
7. 在進行上述步驟的同時，用 EcoR V 徹底酶切 1ug 的質粒載體 pBSⅡ(KS 或 SK)。
酚抽提并用乙醇沉淀以純化酶切產物中的 DNA, 純化產物用水稀釋至 2ng/ul。
8. 在一個 0.5 mlPCR 擴增管中混合以下試劑：
經 BstXI 酶切后的反轉錄 PCR 產物（步驟 6) 5-10ul
10X 擴增緩沖液 4.5ul
dNTP(毎種 1.25 mmol/L) 7.5ul
引物 SADU(20umol/L) 2.5ul
引物 SDDU(20umol/L) 2.5ul
Taq DNA 聚合酶 10~20 單位
加 H20 至 45ul
9. 在另一個 0.5 mlPCR 擴增管中混合以下試劑：
EcoRV 酶切的 pBSⅡ(KS 或 SK）（2ng/ul) 10ul
10x 擴增緩沖液 10ul
dNTP(毎種 1.25 mmol/L) 16ul
引物 BSD-U(20umol/L) 5ul
引物 BSA-U(20umol/L) 5ul
Taq DNA 聚合酶單位 2~4 單位
加 H2O 至 100ul
10. 如熱循環儀無熱蓋，在反應混合物（步驟 8 和 9) 中加入 1 滴（約 50ul) 的輕比重礦物油。或者按熱啟動 PCR 方式加入封口石蠟顆粒。將反應管放入熱循環儀。
11. 按下表列出的變性、復性和延伸參數進行擴增反應。
12.1.5% 瓊脂糖凝膠（TBE 配制） 電泳分析小量 PCR 產物以評價反應質量。反應產物應為典型的彌散條帶（圖 11-19)。
外顯子捕獲產物的克隆
13. 在一個 0.5 ml 的小離心管中加入下列試劑：
BstXI 酶切的 cDNA(步驟 8) 經
步驟 11 擴增反應后產物 3ul
EcoRV 酶切的 pBSⅡDNA(步驟 9) 經
步驟 11 擴增反應后產物 1ul
10x 擴增緩沖液 1ul
DNA 尿嘧啶糖基酶（UDG,1 單位/ul) 1ul
加 H2O 至 10ul
混合后置 37°C 溫育 30 min。
重要：此反應中，含 dU 殘基的 DNA 將被 DNA 尿嘧啶糖基酶降解，另外，帶有互補末端的酶切質粒與擴増的 cDNA 將形成重組子為防止載體與 PCR 產物的非特異結合，37°C 溫育后不要將反應管置于冰上。如不能立即進行步驟 14 和 15, 則將反應管繼續置于 37°C 或-20°C 凍存備用。
14.CaCl2 法將全部 UDG 反應混合物轉化 30~50ul DH5α菌液。
15. 取 100~500ul 的轉化菌液涂布含 50ug/ml 氨芐青霉素的 LB 瓊脂平板，37°C 培養過夜。
階段 5: 克隆分析
材料
緩沖液與溶液
按合適比例稀釋貯存液。
10x 擴增緩沖液
酶及緩沖液
TaqDNA 聚合酶
凝膠
瓊脂糖凝膠（1.5% m/V),TAE 配制
見歩驟 7。
核酸與寡核苷酸
dNTP 溶液，四種核苷酸的濃度均為 1.25 mmol/L
克隆入載體 pBSⅡ中的外顯子捕獲產物
以重組 DH5a 克隆形式制備（見階段 4)。
寡核苷酸引物 [濃度 20 mmol/L 溶于 TE(pH8.0)]
培養基
含 50ug/ml 氨芐青霉素的 LB 肉湯培養基
含 30% 甘油 (v/v) 的 LB 肉湯培養基
專用設備
PCR 用 96 孔微量滴定板
多通道加樣器或加樣裝置（例如 Dank or Scientific 公司產品）
可放入 96 孔微滴定板的熱循環儀
附加試劑
本方案歩驟 8 需要的試劑列在第 12 章，方案 3、4 或 5。
方法
1. 在 96 孔微量滴定板每孔中加入 100ul 含 50ug/ml 氨芐青霉素的 LB 肉湯培養基，并向每個孔中接入一個獨立生長的轉化菌克隆（來自第 4 階段步驟 15)。用 Parafilm 封住平板，37°C 生長 3~4 h, 不需要搖動滴定板。
2. 混合下列組分制備可進行 100 個 PCR 反應的混合物：
10X 擴增緩沖液 250ul
dNTP 溶液（毎種 1.25 mmol/L) 400ul
-20 寡核苷酸引物（20 mmol/L) 125ul
REV 寡核苷酸引物（20 mmol/L) 125ul
H2O 1475ul
Taq DNA 聚合酶 75 單位
在個新的 96 孔 PCR 反應板每孔中加入 24ul 上述混合物。
3. 用 96 孔微量點樣復制裝置將步驟 1 滴定板中的菌液移到含反應混合物的 96 孔 PCR 反應板中。
4, 如使用的熱循環儀不帶熱蓋，在每孔反應液中加入 1 滴（約 50ul) 礦物油。也可采用類似熱啟動的方法，每孔中加入 1 粒固體石蠟。將 96 孔 PCR 反應板置于熱循環儀中。
5. 按下表中的變性、復性及延伸時間和溫度進行 PCR 擴增
6. 用多孔加樣器將步驟 1 制備的菌液復制到另 1 塊滴定板上，37°C 搖菌過夜，每孔中加入 100ul 含 30% 甘油的 LB 肉湯培養基，Parafilm 膜封口后-80°C 凍存。
7. 在 1.5% 瓊脂糖凝膠上電泳分析步驟 5 中每孔的擴增產物。
電泳顯示的擴增條帶應大小不一, 根據大小是無法判斷 ETP 的豐余性 (redundancy), 這是由于 PCR 產物大小集中于 120bp。