基本方案1cDNA合成與印跡

母板

細菌細胞中的標記LB 培養基氨芐青霉素乙醇Super 肉湯培養基甘油96孔堿裂液T low E 緩沖液10 X PCR 緩沖液20 X SSC琥拍酸酐

96深孔板和V 形塑料細胞培養皿水平微量培養板離心96孔多位點復制針1 加侖儲存袋多微孔的帶層帶孔的振蕩器用于深孔板消毒密封的 96 孔板薄 96孔 PCR 孔板和密封的 PCR 板96 孔加熱循環控制裝置微滴定率沖洗板培養箱智能玻片打印機

1.密封的低密度標準培養基中 37°C 培養過夜（大部分賣方提供低密度培養基）。如果已經高密度培養過可以省去這個步驟，否則會降低活性。

2.準備重復的 96 孔板分別標記，每孔中加入 100ul 的含 100 ul/ml 氨芐的培養基。（通過氨芐抗性檢查 EST 克隆）標記孔板以方便辨認。

為保存孔板，一種工作孔板被用做培養基來源（第 2~5 步）。

3.在水平微量培養板離心機上 167 g 離心 2 min, 棄上清。

4.將 96 孔多位點復制針浸入純乙醇溶液中，火燒。冷卻后挑克隆于裝有 LB 的孔板中，可重復操作確保接種。

5.將孔板置于含濕潤帶層的 1 加侖儲存袋中 37°C 培養過夜。

6.在 96 孔板中加人 Iml 含 lOOul/ml 氨節的 Super Broth 中。用多位點復制針接種到新鮮的 LB 中，蓋上蓋后在深孔板振蕩器上 200r/min 37°C 搖 24 h。

7.每孔中加 50ul 45% 滅菌甘油，-80°C 保存。

8.預溫裂解液（來自裂解試劑盒）于 37°C 直到 SDS 溶解。加入 1ml RNase 于 IOOml 重懸液中，4°C 保存。

9.每孔中加 350^1100% 變性乙醇（來自試劑盒）。蓋上濾紙，小心操作以防孔板裝得太滿。

10.1500 g 離心 7 min。迅速倒置棄上清后換上一張干凈的濾紙。要迅速，否則沉淀將浮起或移動。

11.每孔加入 100ul 含 RNase 的重懸液重懸。全部重懸后加入100ul 裂解液，輕輕混勻避免振蕩染色體 DNA。

12.每孔加入 100ul 沉淀液，充分混勻后加 100ul 中和液。混勻后轉移到試劑盒提供的孔板里。

13.1500 名離心 12 min。棄上清后加乙醇洗后濾出。用濾紙吸干多余的乙醇。

14.每孔中加入 500ul 70% 乙醇。迅速倒掉，吸掉多余的乙醇。將孔板放置于一干凈容器中，蓋上干凈濾紙過夜。

15.重懸 DNA 用 200ul T low 溶液。密封讓其在 4°C 溶解至少 2d 才能用。質粒保存溫度為-20°C。

16.擴增 96 孔板中的 DNA，以下是 PCR 反應試劑：

17.標記薄％ 孔 PCR 板，標記供體和受體板在板的 Al 孔處以確定方向。

18.每孔中加 100 ul PCR 反應混合試劑。輕輕加人確定孔底沒有氣泡后，每孔中加入 Ijul 純化的 EST 質粒模板。確定模板都加人到了 PCR 反應試劑中。

19.以下是循環體系：

20.用 2% 的瓊脂糖膠電泳 2ul 的 PCR 產物，選用適當大小的分子標記（支持方案 1)。如果擴增產物已經被證實了，每個孔板只要分析一排就夠了。

21.選取孔板中一排中的一個孔，用熒光測定法分析 1ul 擴增產物（支持方案 2)。

22.每孔加 200ul 乙醇/乙酸鹽溶液于 96 孔 V 形底板。再每孔中加 100ul PCR 產物進行純化，用移液槍混勻 4 次。

23.于-80°C 培養 lh過夜，充分溶化。

24.4°C下2600 g 離心40 min。棄上清，留 10~20u1 在底部避免吸到沉淀。

25.用20ul 70% 乙醇洗沉淀，4℃下2600g 離心 40min。吸去上清讓其在一封閉容器中風干過夜。不要用快速蒸發器。

26.每孔中加40 ul 3 X SSC, 小心密封孔板。將孔板置于加熱儲存袋中。將加熱儲存袋放置在 65°C 培養箱中 2 h，之后讓其自然冷卻。

27.選取孔板中一排中的一個孔分析 1 ul 提純的重懸PCR產物用2% 的瓊脂糖膠跑膠(支持方案1)。查看跑膠條帶。產物于一20°C保存。

28.在轉移PCR產物到玻片前，詳細參看打印筆的說明。

29.用多聚L-賴氨酸包被玻片（支持方案3)。

30.將溶解的純化 PCR 產物 167 g離心2 min。轉移5~10ul PCR產物于孔板中，這將作為打印的原液。

四列直插式打印筆能產生連貫的小點，液體體積要少，打印筆深不能超過 1mm。

31.帶有DNA溶液和連續沉積溶液的筆在玻片上打點。用重復的打印檢查玻片上點的大小和位置。同樣證實了筆能攜帶溶液并打點，這樣簡單的負荷物能產生出我們所需要的玻片。

32.如果一個或者更多的筆沒有在要求的水平，重新清洗或者換另一個筆重新檢測。如果所有的筆都顯示了，進行全部的印記。

33.印記最后，從印記儀上取下片子，在片子邊緣用玻璃刀標明編號和印記標記。并用玻璃刀刻線來標明這片子在第一塊片子上的印記區域。將片子放到清潔的玻片盒，可存放一周。

34.將片子印記的一面向上放置，在一個約 24 cm X 34 cm X 5 cm Pyrex baking 皿中，蓋上塑料蓋。將片子用 450mJ 強度的紫外線照射。將片子轉移到不銹鋼架子上，并將架子置于小的玻璃容器中。

35.溶解 6.Og 琥珀酸酐于 325 ml 1-甲基-2-吡咯酮在玻璃容器中，用玻璃棒攪拌加速溶解。

注意：無菌手套應預熱，并且操作；1-甲基-2-吡咯酮（一種致癌劑）應在化學防護通風櫥內進行。

36.加 25 ml lmol/L 硼酸鈉緩沖液到燒杯中。攪拌混合幾秒鐘，然后迅速傾倒到放片子^玻璃容器中。將玻璃容器放到搖床，70~90r/min 搖 20 min。

37.浸片子到沸水中。立即關掉加熱器，讓片子在熱水中孵育 2 mm。將片子轉移到 1L 盛有無水乙醇的玻璃容器中孵育 4 min。

38.轉移片子到水平離心機中，167 g 離心 3 min。轉移片子到一個清潔的片子盒，豎直放置過夜，準備雜交。