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  • 發布時間:2020-09-07 15:07 原文鏈接: 基因擴增檢驗標本的處理保存及核酸提取方法(2)

    標本的保存

    血清(漿)
    HBV:分離出的血清(漿)如不立即提取核酸,保存于-20℃待檢。
    HCV:盡快分離血清(漿), 如不立即提取RNA, 保存于-20℃待檢。

    長期保存:吸取200μl血清,加20u RNasin(RNA酶抑制劑),保存于-70℃。
    已發出結果報告的標本應及時轉移至冰箱保存,并由專人負責管理,保存1-2周(時間長短根據報告單上的承諾而定)。

    全血標本

    全血標本如用于DNA提取,可4℃下短期保存(數天),時間長易降解,如用于RNA檢測,應在取血后盡快提取RNA。
    最好將DNA或RNA提取后,置-70℃保存。



    液化的痰標本如不立即用于核酸提取,可保存于-20℃。
    處理后的棉拭子、體液、膿液如不立即用于核酸提取,可保存于-20℃。

    組織

    新鮮組織最好保存于50%乙醇中,具體方法:先用生理鹽水將組織洗一次,切成小塊,加入適量生理鹽水,然后邊搖邊加入無水乙醇至終濃度為50%,這樣固定的組織標本室溫下可保存數日,4℃可保存6年。

    總而言之,標本的保存及適當的預處理對核酸模板的成功提取具有決定性作用。要強調的是,所有用于上述處理的容器如試管或離心管,均應在使用前壓滅菌。

    核酸的提取

    核酸包括DNA、RNA兩種分子,在細胞中都是以與蛋白質結合的狀態存在,核酸提取的主要步驟為:
    裂解細胞
    去除與核酸結合的蛋白質以及多糖、脂類等生物大分子,去除其他不需要的核酸分子,如提取DNA分子時,應去除RNA,反之亦然。

    沉淀核酸
    純化核酸,去除鹽類,有機劑等雜質

    (一)DNA提取的經典方法

    DNA提取的經典方法,即所謂的酚-氯仿提取法。因為使用兩種不同的有機溶劑交替抽提更容易將蛋白除去,提取次序為酚、酚/氯仿(1:1)、氯仿,這種方法提取的DNA純度高、片段大、效果好,缺點是較為繁瑣。
    說明:
    回收上層水相時,一定不要接觸兩相的界面,以免將蛋白質等物質吸入新離心管。
    沉淀DNA,無水乙醇是首選的有機溶劑。另:異丙醇、醋酸鈉等。

    70%乙醇漂洗DNA,是為了去除殘余的鹽類,去除過量SDS和酚等雜物,因為SDS在 70%的乙醇中保持溶解狀態,不與DNA共沉淀,從而通過棄上清液去除這種去污劑,避免對以后PCR反應的影響。
    TE緩沖液:10mmol/L Tris-Hcl
    1mmol/L EDTA pH 8.5或 8

    RNA的提取

    RNA提取條件較DNA要求嚴格,主要是因為臨床標本及實驗室環境中,存在大量對RNA有強烈降解作用RNase。 RNase是一類生物活性非常穩定的酶類。這種酶耐酸、耐堿、耐高溫,如煮沸也不能使之完全失活。

    蛋白質變性劑可使之暫時失活,但變性劑去除后,又可恢復活性。除細胞內RNase以外,環境中灰塵、各種實驗器皿和試劑、人體的汗液及唾液中均存在RNase,因此在提取RNA時,關鍵要避免 RNase對標本的污染及防止RNase對提取的RNA的降解。

    1.提取RNA所用器皿的處理及溶液的準備
    塑料制品:如試管、EP管、Tip頭,使用滅菌的一次性用品。

    玻璃用品:如燒杯、試管和其他用品,常被RNase污染,使用前必須于180oC干燥8小時以上,或用0.1%DEPC水(焦碳酸二乙酯)浸泡處理。

    DEPC 是RNase的強抑制劑,作用機制是通過與蛋白質中的組氨酸結合,使蛋白質變性。37℃浸泡2小時,然后用滅菌水漂洗數次,于100℃干烤15分鐘,去除器皿上殘余DEPC。

    所需溶液的配制:必須用高壓滅菌的水和RNA提取專用的化學試劑配制溶液,用干烤過的藥匙稱取試劑,把溶液裝入無 RNase的玻璃器皿。

    嚴格來說,所有溶液均應用0.1%DEPC于37℃處理12小時以上,然后于100℃加熱15分鐘或高壓滅菌15分鐘,去除殘余DEPC。

    2.RNA提取中RNase污染的控制
    最主要的潛在污染源是操作人員的手,手直接觸摸之處毫無疑問會留下 RNase,另外,說話帶出的唾液也富含RNase,故在涉及RNA的一切操作過程中,都應戴一次性手套和口罩。

    實驗中,如接觸了“臟的”玻璃器皿和其他物品以后,手套就可能污染RNase,因此RNA提取實驗中,應勤換手套。


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