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  • 發布時間:2019-04-26 20:36 原文鏈接: 各類上皮細胞培養1

    上皮細胞培養 

    1)表皮細胞培養 

    1.取材:取外科植皮或手術殘余皮膚小塊,以角化層薄者為佳,早產流產兒皮膚更好,切成0.5~1 平方厘米小塊。 

    2.EDTA 處理:先置入0.02%EDTA 中室溫置5 分鐘。 

    3.冷消化:換入0.25%胰蛋白酶中,置4℃過夜。 

    4.分離:取出皮膚,用血管鉗或鑷子把表皮與真皮層分開。 

    5.溫消化:取出表皮單獨處理,用剪刀剪成更小的塊后,置入新的0.25%胰蛋白酶中,37℃再消化30~60 分鐘。 

    6.用吸管輕輕反復吹打,使成細胞懸液。 

    7.培養液:通過80 目不銹鋼紗網濾過后,低速離心,吸上清,直接加入Eagle液和20%小牛血清,制成細胞懸液,接種入碟皿中,CO2 溫箱培養。 

    2) 乳腺組織培養 

    直接培養法:(適于培養含纖維少的軟組織) 

    1.在含有少量培養液或Hanks 液的容器中,用鋒利刀片將組織反復切割成碎塊。 

    2.把組織碎塊連同液體注入離心管中,再補加少許培養液,用吸管吹打片刻,置試管架3~5 分鐘。吸除上層液可排除非乳腺細胞部分。重復2~3 次。 

    3.末次處理結束后,向沉降管中再補加培養液,用吸管稍吹打,使沉降物重懸。不待細胞團塊下降立即通過3~4 層無菌紗布濾入另管中。 

    4.調整好適宜密度,接種入培養瓶中培養。 
    膠原酶消化法:(適于處理含纖維多的較硬組織) 

    其過程與培養其它組織相同。 

    3) 胃上皮細胞培養 

    1.取材:取胃潰瘍或胃癌手術切除胃標本遠端非病變區粘膜少許。 

    2.清洗:用含慶大霉素(400 微克/毫升)和二性霉素(2 微克/毫升的Hanks)液漂洗后,用鈍器剝離下粘膜,剪成1mm3 大小。 

    3.消化:在I 型膠原酶和透明質酸酶中,于37℃中消化80 分鐘。 

    4.離心:收集細胞懸液,800 轉/分離心后,Hanks 液漂洗兩次。 

    5.接種:末次離心后加入含有1%~2%胎牛血清的完全培養基,接種入不同孔數的培養板中,接種量依不同實驗目的而定。 

    4) 肝細胞培養 

    初代組織塊培養: 
    取新鮮肝臟,先剝除被膜和血管等纖維成分,用刀或剪刀把肝臟剪成1mm3 左右的小塊,采用帖壁培養法。 

    初代消化法培養: 

    1.把肝組織切成2~4 立方毫米的小塊,用不含鈣鎂的BSS 液洗兩次。 

    2.移入1:1 的0.1%胰蛋白酶和0.1%膠原酶(都用無鈣鎂BSS 配置)中,4℃冷消化10~12 小時后,通過250 微米和64 微米尼龍網或不銹鋼紗網濾過。 

    3.收集細胞、BSS 液洗1~2 次、計數、接種培養。 

    消化培養肝細胞的另一種方法是灌流法(肝臟灌流需用全肝,以較小動物如小鼠和大鼠為好): 

    1.無菌解剖動物,取出肝臟,先用BSS 洗除血污。 

    2.取5ml 注射器一支,吸取消化液后,把注射器頭輕輕插入肝管中,用線繩結扎牢固,以防消化液漏出,輕輕把消化液注入肝管系統,并不時輕揉壓肝臟,以便消化液進入肝小葉中;消化液在肝內停留20~30 分后,在吸出消化液的同時并輕揉壓肝臟,以使肝細胞脫落和消化液吸出。 

    3.待吸凈消化液后,注入離心管中,低速離心分離,用RPMI 1640 培養基培養(較其它培養基為好),能獲得較純的肝上皮細胞和獲較好的效果。 

    傳代培養: 

    待細胞生長連接成片后,用BSS 洗一二次,加1:1 的0.025%胰蛋白酶和0.02% EDTA 混合消化3~5 分鐘,待細胞回縮,便停止消化,棄掉消化液,用BSS洗一二次,注入營養液,吹打,制成細胞懸液,再接種培養。 

    5)內皮細胞培養 

    1.取產后的新鮮臍帶。如不立即培養可以保存于4℃中,但不宜超過12 小時。無菌剪取長10~15 厘米一段。其它如胚胎和幼體動物的大血管,亦可用于培養。 

    2.先用三通注射器吸溫PBS 液注入臍帶的靜脈中,洗除殘血,注入口處宜用線繩結扎,以防液體返流。 

    3.用血管鉗夾緊臍帶一端,從另端向臍靜脈中徐徐注入最終濃度為0.1%的膠原酶,待末端出現液體后結扎之,令充滿血管,注入口亦應結扎,以防液體返流,消化3~10 分鐘。 

    4.吸出含有內皮細胞的消化液,注入離心管中,為獲取更多細胞,可再注入溫PBS 沖洗2~3 次徹底清除干凈殘余細胞,一并注入離心管中離心。 

    5.吸除上清,加1640 培養液,制成細胞懸液,接種入瓶皿中培養,順利時2~3 天內細胞即可長成單層。 

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