原代腫瘤細胞選擇性培養：匯合飼養層腫瘤細胞篩選實驗

在指數生長中期，用絲裂霉素C處理飼養層細胞，將細胞培養形成匯合的單層。通過膠原蛋白酶消化從活檢標本分離腫瘤細胞，或者用胰蛋白酶消化從原代培養物獲得腫瘤細胞，然后將腫瘤細胞接種到匯合的單層上（圖24.1）。上皮性腫瘤細胞可以在3周至3個月內形成克隆。纖維肉瘤和神經膠質瘤并不總是形成克隆，而可侵入飼養層，并逐漸過渡生長。

3T3細胞STO細胞10T1 2 細胞

生長培養液膠原蛋白酶胰蛋白酶

手術刀Petri 培養皿

一、材料

無菌 

1. 飼養層細胞（如 3T3、STO、10T1/2 或 FHS74Int）

2. 1 mg/ml 絲裂霉素 C（Sigma）

注意：

首次使用飼養層細胞時，最好作絲裂霉素 C 的劑量反應曲線，證實這個劑量能使飼養層細胞存活 2~3 周，但使細胞最多進行兩個倍增后不再繼續增殖。在這種情況下，按如下步驟進行：
（1）將 25 cm² 培養瓶中的細胞用 1~100 μg/ml 絲裂霉素 C 處理過夜（18 h）；
（2）用胰蛋白酶消化細胞后，以 20 ml 新鮮培養液將培養瓶中的全部細胞再接種到 75 cm² 培養瓶中；
（3）將細胞培養 3 周，每周換液 2 次；
（4）將細胞染色，檢查存活的克隆。

2. 生長培養液

3. 2000 U/ml 膠原蛋白酶，CLS 級（Worthington）或相當級別

4. 0.25% 胰蛋白酶，用 PBSA 配制

5. 腫瘤活檢標本或原代培養物

6. 裝有 22 號刀片的手術刀

7. Petri 培養皿，用于解剖，同原代培養中的 Petri 培養皿 

二、操作步驟

1. 在 6 個 75 cm² 培養瓶中，將飼養層細胞培養至 80% 匯合。

2. 加入絲裂霉素 C 至合適的終濃度，一般約為 5 μg/ml。

3. 用絲裂霉素 C 孵育細胞過夜（約 18 h）。

4. 移出含絲裂霉素 C 的培養液，用新鮮培養液浸洗細胞單層。

5. 將細胞進一步培養 24~48 h。

6. 用胰蛋白酶消化細胞，以 5X105 個/ml（1X105 個/cm²）的密度將細胞再接種到 25 cm² 培養瓶中。將細胞培養 24 h。

7. 如果使用活檢標本，需將標本切開，第 2 步放入膠原酶中。

8. 將從標本獲得的細胞懸液以 20~100 mg/瓶接種到兩個 25 cm² 培養瓶中，每瓶含 6 ml 細胞懸液。從每個培養瓶中取出 1 ml 懸液，分別放入另外兩個培養瓶中，加培養液至 4 ml。第 3 對培養瓶作為對照，檢查絲裂霉素 C 處理后飼養層細胞的存活能力。