單分子測序輕松升級參考基因組

　　現代基因組學的最大需求之一，就是得到人類和模式生物的高質量完成基因組。目前，人們利用二代測序技術對越來越多的物種(從原核生物到真核生物)進行了基因組測序，取得了許多重要的研究成果。

　　不過大部分物種的基因組還中存在有大量的缺口gap，就目前的數據來說，各種已測序物種的基因組中缺口gap所占的百分比從1.3%至13%不等。這是由于二代測序技術生成的片段短，而過短的測序片段無法跨越高度重復和高GC含量的基因組區域。大量的基因組空白區域中可能存在有重要的生物學功能信息，如果無法補齊這些缺口，不僅不能獲得完整的基因組物理結構圖，還會給基因組信息的解讀造成不小的困難。目前人們主要使用步進PCR結合Sanger測序或者illumina/454 Pair-end測序數據來填充空白區域，但是這些方法費時費力，成本高，填充效率低，無法從根本上解決問題。

　　美國Baylor醫學院的Richard Gibbs團隊正在進行一項重要研究，利用單分子測序技術對模式生物的基因組草圖進行升級。他們借助的正是Pacbio RS單分子測序的獨特之處，這一技術無需PCR過程，能夠輕松完成高GC含量片段和高度重復區域片段測序。該研究團隊的目標是準確、自動化、快速且可重復的進行基因組升級，他們還專門開發了高度自動化的工具PBJelly，能夠將Pacbio測序得到的長片段與基因組草圖進行比對，填補或減少草圖中的缺口，從而完善基因組草圖。

　　Richard Gibbs的團隊利用PacBio的長讀長，對兩個果蠅種(Drosophila pseudoobscura和Drosophila melanogaster，基因組缺口6.7M，占基因組大小5%)、虎皮鸚鵡(M. undulates，基因組缺口155M,占基因組大小11%)、黑子白眉猴(C.atys，基因組缺口198M，占基因組大小7%)的基因組進行了升級。他們首先利用PacBio單分子測序技術進行覆蓋(深度從4.4×到24×不等)，然后使用PBJelly流程進行分析。研究顯示長讀長數據可以大大降低基因組中的缺口數，其中D. melanogaster的基因組缺口數減少了15倍，虎皮鸚鵡和白眉猴的基因組缺口數減少了1.3至2.8倍，且這些基因組的缺口大小也減少了3-6倍。隨后，研究人員對隨機選擇的96個缺口進行了Sanger測序，驗證了這一方法的可靠性。

　　在這一研究中，單分子測序技術幫助研究者們獲得了很好的結果，大大提高了基因組的完整性，也降低了后續實驗和分析的難度，遠遠優于傳統方法。

　　研究人員對于含有大基因組的脊椎動物(虎皮鸚鵡基因組大小1.2G、黑子白眉猴2.8G)只進行了低深度的測序(4.4-6.8×)就能較好的改善其基因組完整性，說明PacBio測序技術在大型基因組組裝領域具有強大的功能和應用潛力。

　　該項目還在繼續進行中，研究人員將會不斷的改進組裝方法，提高基因組缺口的填補效率。目前，他們正在用這一方法對靈長類動物的基因組進行升級。