化學發光是利用化學反應產生的能量促使產生能級躍遷，從而發光，典型的如魯米諾檢測血跡；熒光是一種光致發光現象，必須提供光源去激發分子產生能級躍遷，進而發光。使用上述兩種方法進行免疫分析時，其區別很明顯，化學發光無需外加光源，背景干擾小；而熒光則需要外加光源，在垂直光源的方向上檢測，生物樣品中的蛋白質、氨基酸等分子也會產生背景熒光，背景稍高一些，需要選擇合適的熒光試劑，以及樣品處理方法以減少非特異性吸附蛋白的影響。
