前列腺原位腫瘤模型的建立可以：（1）連續活體監測前列腺癌發生、發展；（2）用于前列腺原位腫瘤生長及治療的研究；（3）研究前列腺癌的生物學行為。
| 實驗方法原理 | 10只BALB/C裸鼠前列腺背側包膜內注入攜帶紅色熒光蛋白（RFP）的前列腺癌PC-3細胞（PR7細胞）懸液20μL，第2、4、6、8周分別用非侵入式活體分子影像系統觀察前列腺原位腫瘤發生及其轉移情況。尸檢取前列腺原位腫瘤、肺、肝、腎、股骨、盆腔淋巴結等組織，制成冰凍切片，通過熒光顯微鏡下觀察及HE染色等方法分別檢測腫瘤發生及有無轉移等情況。 |
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| 實驗材料 | BALB C裸鼠前列腺癌PR7細胞系 |
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| 試劑、試劑盒 | 飼料飲用水胰酶EDTAHank平衡鹽溶液水合氯醛多聚甲醛蘇木素-伊紅 |
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| 儀器、耗材 | 孵箱倒置熒光顯微鏡凍存管棉簽針頭光學顯微鏡注射器非侵入式活體分子影像系統 |
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| 實驗步驟 | 一、實驗材料準備
1. 雄性BALB/C裸鼠10只，6周齡，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供。飼養SPF條件下超凈層流架內，飼料及飲水自由攝入。 2. 穩定表達紅色熒光蛋白（前列腺癌PR7細胞系）用含5%胎牛血清（體積分數）（杭州四季青生物工程有限公司）的RPMI-1640培養基（美國Gibco公司）在37、5% CO2（體積分數）孵箱內培養，0.25%胰酶+0.02% EDTA混合液（體積分數）消化及傳代。
二、RFP表達情況
倒置熒光顯微鏡下觀察前列腺癌PC-3及PR7細胞RFP表達情況。 三、前列腺原位腫瘤模型的建立
1. 對數生長期PR7細胞用0.25%胰酶+0.02% EDTA混合液（體積分數）消化，Hank平衡鹽溶液（HBSS）洗滌離心后重懸制備2×107/mL細胞懸液，移入無菌細胞凍存管帶至實驗動物中心備用。
2. 裸鼠用10%水合氯醛（體積分數）（4 mL/mg）腹腔注射麻醉后固定，碘伏消毒皮膚后取下腹正中縱切口1 cm，暴露膀胱及精囊腺，棉簽輔助充分暴露前列腺。
3. 一次性1 mL胰島素注射器29G針頭斜面向上小心刺入前列腺包膜內，緩慢注入上述細胞懸液20 μL，可見前列腺包膜明顯鼓起且無外滲，退出針頭，恢復臟器解剖位置，7-0可吸收縫線間斷縫合肌層，4-0絲線縫合皮膚。
4. 待裸鼠蘇醒后回籠。 五、非侵入式活體分子影像系統監測原位腫瘤及轉移情況 術后第2、4、6、8周分別用非侵入式活體分子影像系統（美國Xenogen公司）監測原位腫瘤形成、生長及轉移情況。
六、病理檢查 1. 術后6～8周，所有裸鼠均出現惡液質。
2. 頸椎脫臼法處死，取前列腺原位腫瘤、肺、肝、腎、股骨、盆腔淋巴結。
3. 分別做冰凍切片各2張，切片厚度為10 μm。
4. 各組織分別取1張滴加DAPI（4′，6－二脒基－２－苯基吲哚）染色2 min，用PBS洗3次、每次3 min。
5. 熒光顯微鏡下觀察，綠光激發紅光，紫外光激發藍光。
6. 以原位腫瘤為陽性對照。
7. 另1張用4%多聚甲醛固定10 min后蘇木素－伊紅（HE）染色，普通光鏡下尋找轉移灶。 展開 |
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| 其他 | 一、實驗討論
隨著熒光蛋白的發現及其在生物醫學領域的廣泛應用和動物活體熒光成像技術的發展，在不處死動物的情況下動態觀察原發腫瘤的形成、生長及轉移發生的情況成為可能。應用于標記腫瘤細胞的熒光蛋白主要有RFP和綠色熒光蛋白（green fluorecent protein）。RFP與GFP相比，激發和發射波長較長，且其發射峰位于培養基、培養器材及細胞成分等產生的熒光背景范圍之外，具有較高的信噪比和靈敏度；而且在細胞內熒光轉換效率高，更易檢測。故本實驗選用RFP標記的前列腺癌PR7細胞原位接種于前列腺包膜內，然后用非侵入式活體分子影像系統連續活體觀察熒光信號及其強度的變化來監測原位腫瘤的形成、生長及轉移過程。 目前研究應用較多的前列腺腫瘤模型有皮下接種、前列腺原位接種及血管內接種等模型。將人前列腺癌細胞直接接種于裸鼠皮下的方法簡便易行、易于觀察，但極少發生自發轉移；血管內接種有尾靜脈注射及左心室內接種兩種方法，此法由于沒有原發灶的形成及腫瘤細胞從原發灶分離并侵入血管或淋巴管而發生轉移等重要過程而未被廣泛采用；前列腺腫瘤原位接種模型］的建立方法又可分為前列腺包膜內原位注射細胞懸液及原位瘤塊移植兩種。原位瘤塊移植需先于裸鼠皮下種植腫瘤細胞懸液，待其成瘤后取瘤塊剪碎再通過顯微外科技術將瘤塊移植入裸鼠前列腺內，該方法增加了皮下成瘤的步驟，不同裸鼠移植的瘤塊大小不易控制，且對手術技術要求較高。因而我們采用前列腺包膜內直接注射腫瘤細胞懸液的方法來構建前列腺原位腫瘤模型，該模型由于能較好地模擬前列腺腫瘤發生發展的病理生理過程，且簡便易行，是構建前列腺原位腫瘤模型的重要方法。 本實驗用非侵入式活體分子影像系統于原位注射腫瘤細胞懸液后第2、4、6、8周連續觀察同一批裸鼠前列腺原位腫瘤的形成及生長情況，發現術后第2周體外尚不能觸及腫瘤的情況下已有代表腫瘤細胞的紅色熒光信號，且隨著腫瘤體積的不斷增大，熒光信號也越來越強。說明非侵入式活體分子影像系統對于監測前列腺原位腫瘤形成及生長有較高的靈敏度，可行性強，成功建立了可活體監測前列腺原位腫瘤發生發展的動物模型。另外，傳統病理證實腫瘤或轉移灶的方法為石蠟包埋后切片HE染色觀察。
本實驗中用于構建前列腺原位腫瘤模型的前列腺癌PR7細胞可穩定表達RFP，故我們處死動物后立即取標本做冰凍切片，然后用熒光顯微鏡觀察原位腫瘤及可能發生轉移的組織器官，結果證實原位腫瘤觀察到紅色熒光，而各組織器官均未發現轉移灶，與HE染色病理結果相符。該方法直觀且簡便易行，可在用標記熒光蛋白的腫瘤模型的研究中發揮重要作用。 本實驗建立的前列腺腫瘤模型，并未發現明顯自發轉移灶，可用于前列腺癌的發生機制及篩選抗腫瘤藥物的基礎研究，但局限了其在前列腺癌轉移過程及機制的研究中的應用，可能與裸鼠存活時間過短及細胞系的選擇等因素有關。對于有更高自發轉移發生率的前列腺原位腫瘤的模型的建立，有待進一步探索。 展開 |
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