有人提出, 凍存后轉化效率降低且這種方法不適合大質粒.以下轉貼為coli感受態細胞制備方法,具體方法請最好查閱文獻.
摘要:
但有人提出, 凍存后轉化效率降低, 且這種方法不適合大質粒.以下為轉貼,具體方法請最好查閱文獻E.coli感受態細胞 制備方法：單菌落平板至2ml LB, 37 oC 250 r/m ovn, 1ml 轉至50 ml LB, 37oC 250 r/m至 A600=0....
液氮或低溫冰箱中取出的 大腸桿菌 *E.COLI DH5, JM109,HB101等,在LB平板上劃線,37度過夜至長出單菌落.挑直徑1-3毫米的單菌落*可多個, 接種到250毫升/3升錐形瓶 或80毫升/1升錐形瓶 的SOC培養基. 培養基量不可再多,會影響效率.在18度 150-250RPM 培養19-50小時*沒有冷卻搖床的可在室溫,
但不可高于37度.OD600約0.4-0.8時停止培養, 放在冰水中冷卻10分鐘4度, 300RPM離心15分鐘, 回收菌體去掉上清后, 用1/3體積的冰冷TB溶液懸浮, 在冷10分鐘再次離心回收菌體用1/12.5體積的TB懸浮, 添加最終濃度為7%的DMSO, 再冷卻10分鐘0.1-1毫升分裝, 直接在液氮中凍上.在液氮或-80度保存.
TB溶液*TRANSFORMATION BUFFER
PIPES 3.0G 10mM
CaCl2.2H2O 2.2g 15mM
KCl 18.6g 250mM
add water up to 950ml
用 5N KOH 調PH至6.7-6.8*低PH不溶
在加終濃度未55mM的MnCl2.4H2O 10.9g
定溶到1升, 過濾滅菌, 4度保存.
但有人提出, 凍存后轉化效率降低, 且這種方法不適合大質粒.
【zihudie】
(1)將置于液氮保存的大腸桿菌劃線在LB平板上,37℃培養活化.
(2)挑取經活化的大腸桿菌單菌落于SOC液體培養基,18℃,200-250rpm培養.
(3)當OD600=0.5-0.8時,用預冷的40mL離心管于4℃,8000rpm離心10min,收集菌體.
(4)用預冷的TB Buffer重懸菌體,4℃,8000rpm離心10min,收集菌體.
(5)重復第4步操作.
(6)用8mL預冷的TB Buffer重懸菌體,緩慢加入DMSO至終濃度7% .
(7)冰浴10min后,分裝保存于液氮中.
本法效率極高,建議大家采納
【yog】
1. 單菌落-------2ml LB 37度 120RPM過夜------1%轉接-------37度 200RPM2小時(OD到0.4~0.5)
2. 2ml, 冰浴15min, 4度, 6000RPM 5min, 棄上清, 懸浮于1ml0.1MCaCl2中, 冰浴20min
3. 4度, 6000RPM 10min, 重懸浮于200ul 0.1MCaCl2中, 冰浴30min