20 世紀 70 年代晚期和 80 年代早期，Dong Hanahan 在冷泉港實驗室和哈佛大學做研究生的時候，他做出了以前從未聽說過的轉化效率，并且在以后他的方法被標準化了。本實驗來源「分子克隆實驗指南第三版」黃培堂等譯。
| 實驗方法原理 | 20 世紀 70 年代晚期和 80 年代早期，Dong Hanahan 在冷泉港實驗室和哈佛大學做研究生的時候，他做出了以前從未聽說過的轉化效率，并且在以后他的方法被標準化了。 |
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| 實驗材料 | 質粒 DNA大腸桿菌 |
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| 試劑、試劑盒 | 甲亞砜 DMSODnD 溶液轉化緩沖液 |
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| 儀器、耗材 | SOB 瓊脂板SOC 培養基Sorvall GSA 轉頭或與之相當的轉頭液氮聚丙烯離心管水浴 |
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| 實驗步驟 | 一、材料
1. 緩沖液和溶液
(1) 甲亞砜 DMSO
二甲亞砜的氧化產物據推測為二甲硫醚，是轉化的抑制物。
(2) DnD 溶液（DMSO 和 DTT)
DTT（二硫蘇糖醇）1.53 g，DMSO 9 ml，1 mol/L 乙酸鉀（pH 7.5) 100 μl，H2O 補至 10 ml。
DnD 溶液用可耐受有機溶劑的 Millex SR 膜（Millipore) 過濾除菌，將 DnD 溶液分裝成 160 μl 小份放入 0.5 ml 的無菌微量離心管中，密封管口，貯存于 -20℃。
(3) 轉化緩沖液
標準的轉化緩沖液（TFB）一般現用現配。凍存的緩沖液（FSB）用來凍存（-70℃）感受態細胞。
2. 培養基
(1) SOB 瓊脂板含 20 mmoI/L MgSO4 和適量的抗菌素
標準的 SOB 瓊脂板含 10 mmoI/L MgSO4。
(2) SOB 培養基含 20 mmol/L MgSO4
標準的 SOB 培養基含 10 mmol/L MgSO4。
(3) SOC 培養基
每次轉化反應需 1 ml 的 SOC 培養基。
3. 核酸和寡核苷酸
質粒 DNA （重組質粒）
4. 離心機和轉頭
Sorvall GSA 轉頭或與之相當的轉頭
5. 專用設備
(1) 液氮
(2) 預冷的聚丙烯離心管（50 ml）
(3) 預冷的聚丙烯離心管（17X100 mm；Falcom 2059）
(4) 預置的 42℃ 水浴
6. 載體和菌種
凍存的做轉化用的大腸桿菌
該菌種需在 -70℃ 下保存。
二、方法
1. 細胞的制備
(1) 轉化緩沖液的準備
若制備立即使用的惑受態細胞可用 TFB。若制備貯存于 -70℃ 的感受態細胞則用 FSB。來自配制轉化緩沖液的水的有機物污染會降低感受態細胞的轉化率。因此，采用直接從質量很好的 Milli-Q 過濾系統（Millipore) 取得的水將會得到滿意的結果。假如出現問題，使用前可用活性炭處理去離子水。
① 制備標準轉化緩沖液
A. 1mol/L 的MES 緩沖液的配制：將 19.52 g MES 溶于 80 ml 純水（Milli-Q 級，或與之相當級別的）中，用 5 mol/L 的 KOH 調 pH 至 6.3，最后用純水定容至 100 ml，用預先處理的 Nalgene 濾膜（0.45 μm 孔徑）過濾除菌。以 10 ml/份分裝，于 -20℃ 保存。
B. TBF 溶液的配制：將下表列出的成分溶解于 500 ml 水中，然后加 10 ml 1 mol/L 的 MES 緩沖液（pH 6.3)。最后用純水定容至 1 L。
C. TFB 溶液用預先處理的 NaIgene 濾器（0.45 μm 孔徑）過濾除菌，按 40 ml/份分裝成小份貯存于組織培養瓶（Corning，或與之相當的瓶）中，并置于 4℃ 保存。
② 制備凍存緩沖液
A. 將 9.82 g 乙酸鉀溶于 90 ml 純水（Milli-Q 級或與之相當級別的）中制成 1 mol/L 的乙酸鉀，然后用 2 mol/L 乙酸調 pH 值至 7.5，加純水至終體積為 100 ml，將溶液分成小份，貯存于 -20℃。
B. 配制 FSB 溶液：用 500 ml 純水將下表列出的所有成分溶解，待試劑溶解后，用 0.1 mol/L 的 HCl 調 pH 值至 6.4。如調過頭，不要用堿重調，而應棄去溶液重配。用純水將體積補至 1 L。
C. 溶液用預先處理的 Nalgene 濾膜（0.45 μm 孔徑）過濾除菌。分裝成 40 ml 小份，裝入組織培養瓶（Corning 或與之相當的瓶）中貯存于 4℃。貯存期間，溶液的 pH 值將會下降至 6.1~6.2。此后，pH 值將穩定不變。
(2) 用無菌接種環直接從凍存的大腸桿菌貯存液中所需的菌種在 SOB 瓊脂板表面劃線，于 37℃ 培養 16 h。
沒有必要將凍存菌融化，接種環劃過凍存菌表面所帶的菌已經足夠了。一管凍存菌可以用多次。
(3) 將 4~5 個分隔良好的菌落轉移到 1 ml 含 20 mmol/L MgSO4 的 SOB 中。中速振蕩使細菌分散，然后在 1 L 錐形瓶中用 30~ 100 ml 含 20 mmol/L MgSO4的 SOB 稀釋培養物。
(4) 于 37℃ 將細菌培養 2.5~3 h，監測培養物的生長情況。
為達到高效轉化，活細胞數務必少于 108 細胞/ml，對于大多數大腸桿菌來說，這相當于 OD600 值為 0.4 左右。為保證細菌培養物的生長密度不致過高，可毎隔 15 - 20 min 測定 OD600 值來監測，用檢測的時間及 OD600 值列一個圖表，以便預測培養物的 OD600 值達到 0.4 的培養時間，當 OD600 值達到 0.35 時，收集細菌培養物。
由于未明原因，在大腸桿菌的生長曲線上，有兩個時期的大腸桿菌可以有較高的轉化效率，一個在初期（OD600 =0.4）( Hunahan 1983)，另一個在末期（OD600=0.95）( Tang et al, 1994)。前期收獲的菌容易有效是因為它的高轉化率能持續的時間更長，而后期的生長峰較陡峭，在收集細菌時若稍耽誤 2~3 min，將會使轉化效率降低一個數量級。
在菌株與菌株之間，OD600 值與每毫升中活細胞數間的關系變化很大，因此有必要通過測量特定大腸桿菌的生長培養物在生長周期的不同時相的 OD600 值，并將各稀擇濃度的培養物鋪于無抗生素的 LB 瓊脂板以計算每一時相的活細胞數，從而使分光光度計讀數得到標準化。
(5) 將細菌轉移到一個無菌、一次性使用的、用冰預冷的 50 ml 聚丙烯管中，在冰上放置 10 min，使培養物冷卻至 0℃。
(6) 于 4℃ 以 2700 g（用 Sorvall 轉頭相當于 4100 r/min）離心 10 min，回收細胞。
(7) 倒出培養液，將管倒置 1 min 以使最后殘留的痕量培養液流盡。
(8) 用約 20 ml ( 每個 50 ml 管）冰冷的轉化緩沖液（TFB 或 FSB)，重懸沉淀，將重懸細胞液冰浴 10 min。
(9) 于 4℃ 以 2700 g ( 用 Sorvall 轉頭相當于 4100 r/min) 離心 10 min，回收細胞。
(10) 倒出培養液，將管倒置 1 min 以使最后殘留的痕量培養液流盡。
(11) 用 4 ml ( 每個 50 ml 管）冰冷的轉化緩沖液（TFB 或 FSB ) 輕輕振蕩，重懸沉淀。按步驟 (12) 第一部分給出的操作程序制備立即使用的感受態細胞，而步驟 (12) 第二部分制備貯存于 -70℃ 留待后用的感受態細胞。
2. 感受態細胞的制備
(12) 制備轉化用的感受態細胞
① 新鮮感受態細胞的制備
A. 將 140 μl DnD 溶液加到每一細胞懸液的中心，立即輕輕旋轉以混勻懸液，然后在冰上放置 15 min。
B. 每管再加 140 μl DnD 溶液，輕輕旋轉以混勻懸液，再在冰上放置 15 min。
C. 將小份懸液分裝到冷卻的無菌聚丙稀管（17X100 mm) 中，將管置于冰上。
② 凍存感受態細胞的制備
A. 每 4 ml 重懸細胞液加 140 μl DMSO，輕輕旋轉混勻之，將懸液置冰上 15 min。
B. 每份細胞懸液再加 140 μl DMSO，輕輕旋轉混勻之，置冰上 15 min。
C. 迅速將懸液分裝到冷卻的無菌微量離心管或組織培養管中，封緊管口，沒入液氮中快速冰凍感受態細胞。貯存于 -70℃ 備用。
D. 需要時，從 -70℃ 冰箱中取出一管感受態細胞，把管握于手心，融化細胞。細胞一經融化，立即把管轉移至冰浴中，在冰上放置 10 min。
E. 用一冷的無菌吸頭把感受態細胞轉移到冷卻的無菌聚丙烯管（17 X 170 mm) 中， 放置在冰浴上。
3. 轉化
包括陽性和陰性對照。
(13). 將要轉化的 DNA 片段加入到裝有感受態細胞的管中（50 /4 感受態細胞需 25ngDNA)，體積不應超過感受態細胞的5%，輕輕旋轉幾次混勻內容物。實驗中至少 設兩個對照管：一個含有感受態細胞和已知量的超螺旋質粒DNA，另一管只有感 受態細胞。混勻內容物，冰浴 30 min。
(14) 將管放入預加溫至 42℃ 的循環水中，恰恰放置 90 s，不要搖動管。
熱激是一個關鍵步驟，準確地達到熱激溫度非常重要。這里的溫度及溫育的時間都是使用 Falcon 2059 管 的測量參數，其他類型的管將可能獲得不同的結果。
(15) 快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻 1~2 min。
(16) 每管加 800 μl SOC 培養基，用水浴將培養基加溫至 37℃，然后將管轉移到設置為 37℃ 的搖床上，溫育 45 min，使細菌復蘇并表達質粒編碼的抗生素抗性標記基因。
為最大限度地提高轉化率，復蘇期中應溫和地搖動細胞（< 225 r/min）。
如果帶有 α 互補，請接 “ 用 X-gal 和 IPTG 篩選細菌菌落：α 互補”。
(17) 將適當體積（每個 90 mm 平板達 200 μl ) 已轉化的感受態細胞轉移到含 20 mmol/L MgSO4 和相應抗生素的 SOB 培養基上。
如果用四環素作為選擇標記，全部的轉化混合物可以鋪在一個單獨的平皿上（或軟瓊脂中），可以先在微量離心機上室溫離心 20 s 以收集轉化菌，在輕拍管壁的同時加入 100 μl SOC 重懸沉淀。
重要：玻璃鋪菌器先需在乙醇中浸泡，然后在酒精燈上灼燒，待它涼至室溫后，才可將轉化菌輕輕地鋪在瓊脂板表面。
如檢査氨芐青霉素的抗性，用轉化菌鋪平板時密度應較低（每個 90 mm 平板不超過 104 菌落 )，于 37℃ 培養的時間不超過 20 h。氰芐青霉素抗性的轉化體可將 β-內酰胺酶分泌到培養基中，迅速滅活菌落周圍區域的青霉素。這樣，鋪平板時密度過高或培養時間過長都會導致出現對氰芐青霉索敏感的衛星菌落。在選擇培養基中不用氨芐青霉素而用羧芐青霉素，以及將抗生素濃度從 60 μg/ml 提高到 100 μg/ml，可使情況有所改善，但不能徹底根除之。抗氨芐青霉素菌落的增加與平皿上所加的細菌數的增加并無線性比例關系，這可能是因為被抗生素殺死的細胞釋放生長抑制物質的緣故。
(18) 將平板置于室溫直至液體被吸收。
(19) 倒置平皿，于 37℃ 培養，12~16 h 后可出現菌落。 |
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