制備色譜技術與操作（四）

5.水污染(反相)
通過變化平衡時間檢查水質量，用HPLC級的水
(六) 基線噪聲
1.氣泡(尖銳峰)
流動相脫氣,加柱后背壓
2.污染(隨機噪聲)
清洗柱,凈化樣品,用HPLC級試劑
3.檢測器燈連續噪聲
更換氘燈
4.電干擾(偶然噪聲)
采用穩壓電源,檢查干擾的來源(如水浴等)
5.檢測器中有氣泡
流動相脫氣,加柱后背壓
(七) 峰拖尾
1.柱超載
降低樣品量,增加柱直徑采用較高容量的固定相
2.峰干擾
清潔樣品,調整流動相
3.硅羥基作用
加三乙胺,用堿致鈍化柱增加緩沖液或鹽的濃度降低流動相PH值,鈍化樣品
4.同前(四)4
同前(四)4
5.同前(四)3
5.同前(四)3
6.死體積或柱外體積過大
連接點降至最低,對所有連接點作合適調整,盡可能采用細內徑的連接管
7.柱效下降
用較低腐蝕條件,更換柱,采用保護柱
(八) 峰展寬
1.進樣體積過大
同(四)1
2.在進樣閥中造成峰擴展
進樣前后排出氣泡以降低擴散
3.數據系統采樣速率太慢
設定速率應是每峰大于10點
4.檢測器時間常數過大
設定時間常數為感興趣第一峰半寬的10%
5.流動相粘度過高
增加柱溫,采用低粘度流動相
6.檢測池體積過大
用小體積池,卸下熱交換器
7.保留時間過長
等度洗脫時增加溶劑含量也可用梯度洗脫
8.柱外體積過大
將連接管徑和連接管長度降至最小
9.樣品過載
進小濃度小體積樣品
藥物分析實驗數據處理
實驗數據中各變量的關系可表示為列表式，圖示式和函數式。
列表式：將實驗數據制成表格。它顯示了各變量間的對應關系，反映出變量之間的變化規律。它是標繪曲線的基礎。圖示式：將實驗數據繪制成曲線。它直觀地反映出變量之間的關系。在報告與論文中幾乎都能看到，而且為整理成數學模型（方程式）提供了必要的函數形式。
函數式：借助于數學方法將實驗數據按一定函數形式整理成方程即數學模型。
    熟悉相關和回歸的定義，相關系數的定義，直線回歸的最小二乘法。
　
熟悉藥品質量標準分析方法驗證中各項指標的定義和考察方法。
含量測定方法的評價 (效能指標—分析品質因數)
一般常用的分析效能評價指標包括：精密度、準確度、檢測限、定量限、選擇性、線性與范圍、重現性、耐用性等；測定法的效能指標可評價分析測定方法,也可作為建立新的測定方法的實驗研究依據。
1.精密度系指用該法測定同一勻質樣品的一組測量值彼此符合的程度。它們越接近就越精密。在藥物分析中，常用標準(偏)差(SD或S)； 相對標準(偏)差(RSD)，也稱變異系數(CV)，表示。
生物樣品分析時，常用RSD表示精密度，并可細分為批內(或日內)精密度及批間(或日間)精密度。
批內精密度：是同一次測定的精密度。通常采用高、中、低三種濃度的同一樣品各7-10份，每種濃度的樣品按所擬定的分析方法操作，一次開機后，一一測定。計算每種濃度樣品的SD值及RSD值。批內精密度也可視為日內精密度。所得RSD應爭取達到5％以內，但不能超過10%。
批間精密度：是不同次測定的精密度。通常采用高、中、低三種濃度的同一樣品，每種濃度配制7-10份，置冰箱冷凍。自配制樣品之日開始，按所擬定的分析方法操作，每天取出一份測定，計算每種濃度樣品的SD值及RSD值。批間精密度也可視為日間精密度。所得RSD應控制在15％以內。
2.準確度是指測得結果與真實值接近的程度，表示分析方法測量的正確性。
由于“真實值”無法準確知道，因此，通常采用回收率試驗來表示。
制劑的含量測定時，采用在空白輔料中加入原料藥對照品的方法作回收試驗及計算RSD，還應作單獨輔料的空白測定。每份均應自配制模擬制劑開始，要求至少測定高、中、低三個濃度，每個濃度測定三次，共提供9個數據進行評價。
回收率＝（平均測定值M -空白值B）/ 加入量A×100％
回收率的RSD一般應為2％以內。
3.檢測限(LOD)是指分析方法能夠從背景信號中區分出藥物時，所需樣品中藥物的最低濃度，無需定量測定。
LOD是一種限度檢驗效能指標，它既反映方法與儀器的靈敏度和噪音的大小，也表明樣品經處理后空白(本底)值的高低。要根據采用的方法來確定檢測限。當用儀器分析方法時，可用已知濃度的樣品與空白試驗對照，記錄測得的被測藥物信號強度S與噪音(或背景信號)強度N，以能達到S／N＝2或S／N＝3時的樣品最低藥濃為LOD；也可通過多次空白試驗，求得其背景響應的標準差，將三倍空白標準差(即3δ空或3S空)作為檢測限的估計值。為使計算得到的LOD值與實際測得的LOD值一致，可應用校正系數(f)來校正，然后依之制備相應檢測限濃度的樣品，反復測試來確定LOD。如用非儀器分析方法時，即通過已知濃度的樣品分析來確定可檢出的最低水平作為檢測限。
4.定量限 (LOQ)是指在保證具有一定可靠性(一定準確度和精密度)的前提下，分析方法能夠測定出的樣品中藥物的最低濃度。
它反映了分析方法測定低藥物濃度樣品時具有的可靠性。它與上述的檢測限的差別在于：定量限要定量測定某一藥物在樣品介質中的最低濃度，且定量限規定的最低濃度應該符合一定的精密度和準確度的要求。確定定量限的方法也因所用方法不同而異。當用非儀器分析方法時，與上述檢測限的確定方法相同；如用儀器分析方法時，則往往將多次空白試驗測得的背景響應的標準差(即空白標準差)乘以10，作為定量限的估計值，繼之，再通過分析適當數量已知接近定量限或以定量限制備的樣品來驗證。
5.選擇性是指在樣品介質中有其他組分共存時該分析方法對供試物質準確而專屬的測定能力。
它與專屬性的含義稍有不同。專屬性是指一種方法僅對一種分析成分產生唯一信號；選擇性則可對多種化學成分產生不同響應，而主要成分的響應可與其它響應區分。
因此，選擇性是指該法用于復雜樣品分析時相互干擾程度的量度。
在藥物分析中考察一個分析方法的選擇性時，應著重考慮雜質、降解產物、相關化合物以及制劑輔料等其他組分是否對被測藥物的測定有干擾。一般，通過添加上述物質的樣品與未曾添加的樣品所得分析結果進行比較而確定。
6.線性與范圍
分析方法的線性是在給定范圍內獲取與樣品中供試物濃度成正比的試驗結果的能力。換句話說，就是供試物濃度的變化與試驗結果(或測得的響應信號)成線性關系。
所謂線性范圍是指利用一種方法取得精密度、準確度均符合要求的試驗結果，而且成線性的供試物濃度的變化范圍，其最大量與最小量之間的間隔，可用mg／L ~ mg／L、 ug／ml ~ ug／ml等表示。
線性與范圍的確定可用作圖法(響應值Y／濃度X)或計算回歸方程(Y＝a+bX)來研究建立。
測定樣品時所有生物藥物分析方法都必須同時作標準曲線。每次作標準曲線時，方法應與分析方法考核時完全一致。標準濃度應包括一定梯度的5-8個濃度(非線性者如免疫分析可適當增加)，每個濃度只需測定一次(免疫分析可測定兩次并取均值)；標準曲線應覆蓋樣品可能的濃度范圍，對于含量測定要求一般濃度上限為樣品最高濃度的120％，下限為樣品最低濃度的80％ (但應高于LOQ)；目前仍廣泛采用相關系數(r)表示標準曲線的線性度、并控制r≥0.9900。對照品的LOQ必須包括在線性范圍。
7.耐用性 是指利用相同的方法在各種正常實驗條件下對同一樣品進行分析所得結果的重現程度。
所謂各種正常實驗條件，包括不同的實驗室、不同的分析人員、不同的儀器、不同批號的試劑、不同的測試耗用時間、不同的分析溫度、不同的測定日期等等。分析方法重現性的測定是通過在不同實驗室由不同的實驗者(操作和環境條件雖有差別但仍在規定的分析參數內)對同一樣品的分別測試而獲得的。
重現性 即是指在不同實驗室中使用此種分析方法的精密度。是評價其保持不受參數微小變差影響的能力，并可作為正常使用的一個可靠性指標。
8. 與參比方法測得結果的相關程度的比較
由于生物樣品中含有許多干擾測定的雜質，特別是與原型藥物相似的代謝物常對藥物的測定有影響。因此，除考察選擇性外，有時還用參比方法對實際生物樣品同時測定并進行比較。比較試驗時，取若干份實際樣品 (如病人服藥后采取的血樣)，用一個已證明有相當專屬性和可靠性的方法與新建立的方法同時進行測定，以參比方法測得的藥濃為橫坐標(X)，以新建立方法測得的藥濃為縱坐標(Y)作成散布圖，并求出直線回歸方程 (y＝a+bx)及相關系數 (r)。r最大值為1，表示兩法完全相關(結果完全吻合)；r＝0時，表示兩法完全不相關。一般要求兩法的相關系數r＞0．95，而相關直線的斜率 (b) 應接近于1。
評價一種分析方法的效能，一般根據方法的使用對象區別。有以下四種情況：
A．用于原料藥中主要組分或制劑中有效組分含量測定的方法：除了檢測限和定量限二項指標外，對精密度、準確度、選擇性、線性與范圍、耐用性等均應有所要求；
B．用于原料藥中雜質測定或制劑中降解產物測定的方法又可分為兩種：
①用于含量測定；要求是：除檢測限和精密度指標不必要求外，對準確度、選擇性、線性與范圍、定量限、耐用性等均應有所要求；
②用于限度檢查。要求是：只對檢測限、選擇性和耐用性三項指標有所要求，其余均無需要求。
C．用于溶出度測定的方法及藥物釋放度測定的方法，只有精密度和耐用性有所要求，其余項目均不作要求。 D．用于生物樣品中藥物測定的方法，對精密度、準確度、檢測限、選擇性、可測線性范圍、定量限、對生物樣品的耐用性以及與參比方法測得結果的相關程度的比較等指標應有所要求。