利用BIAcore分析相互作用的蛋白質

Biacore是基于表面等離子體共振（SPR）技術來實時跟蹤在天然狀態下生物分子間的相互作用，無需任何標記物。表面等離子體共振（surface plasmonresonance，SPR）是一種光學現象，在傳感芯片發生全反射界面上有一層約50nm厚的金屬膜，偏振光入射到棱鏡的一端，在棱鏡與金屬膜的界面會產生表面等離子波，當入射光波的傳播常數與表面等離子波的傳播常數匹配時，金屬膜內的自由電子會產生共振，即表面等離子共振體。

分析時，先將一種生物分子即配體（蛋白、抗體等）偶聯在生物傳感器表面，再將含有另一種能與靶分子產生相互作用的生物分子（分析物）的溶液注入并流經生物傳感器表面。生物分子間的結合引起生物傳感器表面質量的增加，導致折射率的變化，通過監測SPR的角度變化，可自動獲得分析物的動力學結合和解離常數、親和力及特異性等。生物分子間反應的變化即被觀察到。

蛋白樣品

EDC 氨基乙醇 Extraclean HEPES 緩沖的鹽水緩沖液 HCl NHS 小鼠抗-TSH 單克隆抗體 兔抗小鼠-Fc 結構域 TSH TSH 稀釋液

BIAcore 儀器 CM-5 傳感芯片

第一階段  捕獲表面的制備和結合試驗

材料

緩沖液和溶液
將貯存溶液稀釋到適當的濃度。

EDC[0.2mol/L 的 N-乙基-N'-（二甲氨基丙基）-碳化二亞胺的水溶液]

氨基乙醇（1ml/L 鹽酸乙醇胺，用 NaOH 調節至 pH8.5）

Extraclean
Extraclean 是一種用于表面再生的溶液, 可由 BIAcore 購得。

HEPES 緩沖的鹽水緩沖液
10 mmol/L HEPES(pH7.4)
150 mmol/L NaCl
3 mmol/L EDTA
0.005%(V/V) 吐溫-20
該緩沖液可以從 BIAcore 購得。

HCl(20 mmol/L)

NHS(0.05 ml/L 的 N-羥基琥珀酰亞胺水溶液）
EDC, 氨基乙醇以及 NHS 是由 BIAcore 購得的 Amine-coupling Kit 中的一部分

抗體



小鼠抗-TSH 單克隆抗體（lmg/ml，溶于 HEPES 緩沖鹽水）
該抗體可以從 Alexon Trend,Inc. 購得。

兔抗小鼠-Fc 結構域 (RAMc)(30ug/ml, 溶于 l0 mmol/L 的 pH5.0 醋酸鈉溶液)
該抗體可以從 BIAcore 購得。

TSH(20umol/L，溶于 HEPES 緩沖鹽水）
TSH 可以從 Alexon Trend,Inc. 購得。

專用裝置

BIAcore 儀器
該儀器包括 BIAcore 控制軟件和 BIA 評價軟件。
設備和軟件可以從 BIAcore,Inc. 購得，相關的信息可査閱 www.biacore.com。

CM-5 傳感芯片

方法

RAMc 通過伯氨基與 CM-5 傳感芯片表面的結合
這一步要用約 45 min。通過下拉菜單或 BIAcore 控制軟件工具欄中的圖標來執行操作命令。

1. 將 CM-5 傳感芯片模塊嵌入 BLAcore 儀器。

2. 全部采用過濾并除氣的 HEPES 緩沖鹽溶液。

3. 將分別含有 NHS、EDC、乙醇胺和 RAM Fc 以及 20 mmol/L HCl 各 100 的小管置于 BIAcore 自動進樣器架的適當位置。

4. 將一個空管置于 BIAcore 自動進樣器架上。
如果采用的是 Immobilization Wizard，則可以進行這一步。(Wizards 是 BIA2000 和 BIA3000 中 BlAcore 控制軟件 3.0 版本或更高版本的標準配制。）使用 Wizard 的話，按規定體積添加樣品。結合 RAM Fc 的 RUs 目標數為 13000。

5. 開動儀器，以 5ul/min 的流速流過一個流動池。

6. 將 75ul 的 NHS 加入到一個空管中。

7. 在同一管中再加入 75ul 的 EDC。

8. 將含有 NHS 和 EDC 的小管中的成分混勻。

9. 注射 35ul NHS/EDC 混合物使表面活化。

10. 注射 35ul RAM Fc 到活化表面與抗體結合。

11. 注射 35ul 乙醇胺使過量的反應基團失活。

12. 快速注射 10ul 的 20 mmol/LHCl, 然后用 Extradean 除去非共價結合型材料。

13. 通過在開始注射 RAMc 前放置一個基線報道點，并在注射 20 mmol/L HCl 結束后 2 min 放置第二個報道點，來測定結合 RAMc 的水平。
固定 RAMc 的最終 RUs 值應該介于 10000 到 13000 之間；如果所得值偏低，可能是由于所用的 RAMc 濃度太低，或使用了貯存期超過 2 個月的 NHS 或 EDC 溶液。RAMc 的 RUs 值較低的表面仍然可以使用，但抗 TSH 的體積必須按經驗進行調整；通常地，需要更多的抗-TSH 以達到期里的結合水平。

14. 關閉流動液，關閉命令窗口，保存報道文件。
在這時 BIAcore 可以處于預備（繼續）狀態，也可以在下一階段直接使用表面。當緩沖液在儀器內保持流動時，RAMc 表面在機器里是非常穩定的。另外，芯片也可以拿出來保存在 4°C、含有少量水的 50 ml 錐形管中；以這種方式保存時表面可以穩定凡個星期。
檢測抗-TSH 與 RAMc 表面的結合這一步要用約 20 min。通過下拉菜單或 BLAcore 控制軟件工具欄中的圖標來執行操作命令。

15. 開動儀器，使含有結合 RAMc 的流動池的流速為 10ul/min。

16. 注射 10ul 的 2ug/ml 抗-TSH(這需要總共 40ul 的抗-TSH 溶液）。
10ul 的抗-TSH 可以提髙約 250 個 KUs。如果 RAMc 表面的結含不能達到這種水平，再生（見第 17 步）并重復注射不同體積的抗-TSH，直至確定所需的注射體積。

17. 快速注射 10ul 的 20 mmol/L HCl，然后用 Extraclean 再生 RAMc 表面。

18. 為了測定結合到 RAMc 表面的重現性，用可以與抗 TSH 結合引起 250RUs 所需的體積重復注射抗 TSH。

19. 快速注射 10ul 的 20 mmol/L HCl，然后用 Extradean 再生 RAMc 表面。

20. 關閉流動液體，關閉命令窗口，保存報道文件。
檢測 TSH 與捕獲抗-TSH 表面的結合
這一步要用約 20 min。通過下拉菜單或 BIAcore 控制軟件工具欄中的圖標來執行操作命令。

21. 開動儀器，使含有結合 RAMc 的流動池的流速為 10pl/min。

22. 注射 10ul 的 2ug/ml 抗-TSH(或者注射第 15~20 步所測得的、與抗-TSH 結合引起 250RUs 所需的體積)。

23. 注射 25ul 的 200nmol/LTSH, 限定 120s 的解離時間（這需要總共 65ul 的 TSH 溶液)。120s 的解離時間就可以測得抗原-抗體復合物解離的速率。
注射約 20ul 的 200nmol/LTSH 以后，曲線會變平（斜率達到零)，表示在抗原和抗體分于間的相互作用達到瞬時穩態。如果曲線沒有變平，就再生表面，并將第 23 步中 TSH 的濃度改為 400nmol/L 后，重復第 21~23 步（見圖 18-26 和圖 18-27)。

24. 快速注射 10ul 的 20 mmol/LHCl, 然后用 Extraclean 再生 RAMc 表面。

25. 關閉流動流，關閉命令窗口，保存報道文件。




第二階段  抗原-抗體相互作用的動力學分析

材料

緩沖液和溶液
將貯存溶液稀釋到適當的濃度。

HEPES 緩沖的鹽水緩沖液或適當的沖洗緩沖液
10 mmol/LHEPES(pH7.4)
150 mmol/LNaCl
3 mmol/LEDTA
0.005%(V/V) 吐溫-20
該緩沖液可以從 BIAcore 購得。

抗體

小鼠抗-TSH 單克隆抗體（lmg/ml, 溶于 HEPES 緩沖鹽溶液）
該抗體可以從 Alexon Trend,Inc. 購得。
將抗體稀釋到 2ug/ml 并制備 1000ul 或所需體積）來達到第一階段第 15~20 步所測得的目標共振單位。

TSH(20umol/L，溶于 HEPES 緩沖鹽溶液）
TSH 可以從 Alexon Trend，Inc. 購得。

制備一系列注射用 TSH 稀釋液：

1. 制備濃度為 200、100、50、25、10 以及 5nmol/L 的不同稀釋液，每一份均溶于 280ul 的流動緩沖液中用于實驗。
2. 每個濃度按每份 70ul 分裝于四個 7 mm 塑料小瓶中，每個小瓶加蓋。
3. 將小瓶按樣品循環參數的指示放置在 BIAcore 管架的適當位置。

專用裝置

BIAcore 儀器
該儀器包括 BIAcore 控制軟件和 BIA 評價軟件。
設備和軟件可以從 BIAcore,Inc. 購得，相關的信息可査閱 www.biacore.com。

CM-5 傳感芯片，按第一階段的介紹與 RAMc 結合。

方法

下列程序由三種方法模塊或小段所組成：主程序、定義分析程序（DEFINEAPROG) 以及定義樣品。注意一共有四個定義分析程序模塊，在這四個程序中每一個均代表了主程序中的一部分（模塊 1、模塊 2、模塊 3 以及模塊 4)。當用軟件編輯一個方法時，方法命令應釆用大寫字母書寫，用戶所定義的參數用小寫字母書寫。

后跟感嘆號（！）的部分注釋儀器會認為是文字而非命令代碼，會插入解釋前一條命令的含義。

樣本的要求

1. 通過等電聚焦或者使用軟件預測，確定待分析蛋白的等電點。對等電點高于7或者小于3的蛋白一般不推薦進行 Biacore 分析，特殊需求可與相關技術人

員進行個例商討。

2. 固定于傳感片上的靶蛋白（例如：受體蛋白）和待分析蛋白，純度要達到95％以上。

3. 用 PBS（或者用戶蛋白所需的特殊緩沖液）對蛋白溶液進行透析，然后濃縮至 200ug/ml～1mg/ml 的濃度。

4. 化合物溶解在含 1‰ DMSO 的 HBS 緩沖液中，并稀釋成  10-5M 和 10-6M 兩種濃度進行初步分析；初步分析呈陽性的化合物再用含 1‰ DMSO 的緩沖液稀釋成 10-5M， 5×10-6M， 2×10-6M， 1×10-6M， 5×10-7M 和 1×10-7M 的濃度梯度進行動力學常數分析。

5. 如果化合物無法溶解在含 1‰ DMSO 的 HBS 緩沖液中，則可以提高 DMSO的濃度，最高可至 1%的濃度。同時配制相應濃度的DMSO 緩沖液作為對照進行實驗。

本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）下冊，作者：〔美〕J. 薩姆布魯克 D.W. 拉塞爾。